1.rnai介導(dǎo)的insig1基因抑制對(duì)炎癥小鼠脂質(zhì)代謝的影響和分子機(jī)制研究;2.老年人非高密度脂蛋白膽固醇與冠心病相關(guān)性分析

1、重慶醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文1.RNAi介導(dǎo)的Insig-1基因抑制對(duì)炎癥小鼠脂質(zhì)代謝的影響和分子機(jī)制研究 2.老年人非高密度脂蛋白膽固醇與冠心病相關(guān)性分析姓名：柯大智申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：老年醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：陳慶偉201105重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文第二部分 I n s i g - 1 基因沉默對(duì)炎癥狀態(tài)下R A W 2 6 4 ．7 小鼠巨噬細(xì)胞脂質(zhì)代謝的影響目的：觀察一R N A i 沉默I n s i g - 1 基因?qū)ρ装Y狀

2、態(tài)下小鼠巨噬細(xì)胞R A W 2 6 4 ．7 脂質(zhì)代謝的影響。方法：R A W 2 6 4 ．7 細(xì)胞接種于2 4 孔板2 4 小時(shí)，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染干擾載體p G e n - I n s i g - - 1 —2 和p G e n ·I n s i g - l —l t C ，2 4 小時(shí)后經(jīng)G 4 1 8 篩選1 4天獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。R T - P C R 、w e s t e r n b l o t 和免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定

3、穩(wěn)定干擾株I n s i g —l 的表達(dá)。不同濃度L D L 和L P S 負(fù)荷細(xì)胞下，w e s t e r n b l o t檢測(cè)L D L r 蛋白的表達(dá)，以確定L D L 和L P S 后續(xù)處理細(xì)胞的濃度。以篩選濃度的L D L 和L P S 共同刺激p G e n —I n s i g - 1 - 2 ／R A W 2 6 4 ．7 細(xì)胞和p G e n ．I n s i g - 1 一n c ／R A W 2 6 4 ．7

4、 細(xì)胞( 以未轉(zhuǎn)染R A W 2 6 4 ．7 細(xì)胞作陰性對(duì)照) ，利用酶學(xué)方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)總膽固醇( T C ) 、游離膽固醇( F C ) 和膽固醇酯( C E ) 的水平；油紅0 染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚情況；提取細(xì)胞總R N A 和總蛋白，應(yīng)用R T - P C R 和w e s t e r nb l o t 檢測(cè)I n s i g - 1 、S C A P 、S R E B P ．2 和L D L r 的m R N A 和蛋白表達(dá)

5、水平。結(jié)果：干擾載體轉(zhuǎn)染R A W 2 6 4 ．7 ，經(jīng)G 4 18 篩選后得到穩(wěn)定干擾株，分別命名為p G e n - I n s i g —l - 2 ／R A W 2 6 4 ．7 細(xì)胞和p G e n —I n s i g - 1 - n c／R A W 2 6 4 ．7 細(xì)胞，經(jīng)R T - P C R 、w e s t e r nb l o t 和免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果證實(shí)p G e n —I n s i g - 1 —2 ／R

6、A W 2 6 4 ．7 穩(wěn)定干擾株內(nèi)I n s i g - I m R N A 和蛋白表達(dá)較p G e n —I n s i g —l —n o ／R A W 2 6 4 ．7 和未轉(zhuǎn)染洲2 6 4 ．7 細(xì)胞顯著降低( P < O ．0 5 ) 。通過L D L r 的蛋白表達(dá)篩選出處理細(xì)胞的L D L 和L P S 濃度分別為5 0l a g ／m l 和2 0 0 n g ／m l 。油紅O 染色結(jié)果顯示當(dāng)負(fù)荷5 0 ug