bnaa.ban.a調(diào)控甘藍(lán)型油菜種皮色素成分的研究

1、朱寶：占h 以．B A N ．a(chǎn) 調(diào)控甘藍(lán)型油菜種皮色素成分的研究目錄摘要?????????????????????????????????????．i i iA b s t r a c t ??????????????????????????????．?????????????．?．???．v中英文對(duì)照表?????????????????????????????????．v i i第一章文獻(xiàn)綜述????????????????????

2、????????????11 ．1 油菜的經(jīng)濟(jì)地位及其育種現(xiàn)狀??????????????????????．．11 ．2 黃籽油菜的研究?jī)r(jià)值及育種現(xiàn)狀?????????????????????．．11 ．3 油菜黃籽性狀分子調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展??????????????????．．21 ．3 ．1 類(lèi)黃酮合成途徑相關(guān)化合物的研究進(jìn)展????????????????21 ．3 ．2 類(lèi)黃酮合成途徑分子機(jī)制的研究進(jìn)展????????????

3、?????41 ．3 ．3 轉(zhuǎn)錄因子對(duì)類(lèi)黃酮合成途徑調(diào)控的研究進(jìn)展??????????????61 ．3 ．4 花青素還原酶基因( 鰣Ⅳ) 結(jié)構(gòu)和功能的初步研究??????????．1 01 ．4 本研究的目的和意義??????????????????????????．1 1第二章材料和方法???????????????????????????????1 22 ．1 實(shí)驗(yàn)材料???????????????????????????????

4、。1 22 ．2 菌株與質(zhì)粒???????????????????????????????1 22 ．3 試劑與儀器???????????????????????????????1 22 ．4 實(shí)驗(yàn)方法????????????????????????????????1 22 ．4 ．1 日”朋Ⅳ的生物信息學(xué)分析?????????????????????。1 22 ．4 ．2 黃、褐籽甘藍(lán)型油菜不同發(fā)育時(shí)期種子中B n B A N 的表達(dá)

5、水平分析???．1 32 ．4 ．3B n a A ．朋Ⅳ．口在甘藍(lán)型油菜不同組織中的表達(dá)量分析??????????1 52 ．4 ．4B n a A ．B A N ．a(chǎn) 表達(dá)蛋白在細(xì)胞中的定位????????????????．1 52 ．4 ．5B n a A ．B A N ．a(chǎn) 過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建???????????????????．1 72 ．4 ．6B n a A ．B A N ．a(chǎn) 干擾載體的構(gòu)建???????????????

6、?????．1 72 ．4 ．7B n a A ．B A N ．a(chǎn) 干擾載體及過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌????????????1 82 ．4 ．8B n a A ．B A N ．a(chǎn) 干擾載體及過(guò)表達(dá)載體的油菜遺傳轉(zhuǎn)化??????????1 82 ．4 ．9T o 代轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)???????????????????????2 02 ．4 ．1 0T l 代轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)??????????????????????．2 1第三章 結(jié)果與

7、分析???：???????????????????????????2 43 ．1B n B A N 基因的生物信息學(xué)分析??????????????????????2 43 ．1 ．1 四h 刪Ⅳ四條拷貝數(shù)的生物信息學(xué)分析????????????????．2 43 ．1 ．2B n B A N 不同拷貝數(shù)的同源性比較分析????????????????．2 43 ．1 ．3B A N 基因在蕓苔屬作物中的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系??????????

8、????．2 63 ．2B n B A N 不同拷貝在黃、褐籽不同發(fā)育時(shí)期的相對(duì)基因表達(dá)量????????．．2 73 ．3 甘藍(lán)型油菜不同組織與種子不同發(fā)育時(shí)期B n a A ．B A N ．a(chǎn) 的表達(dá)量分析?????2 83 ．4B n a A ．B A N ．a(chǎn) 在煙草中的蛋白定位研究???????????????????2 93 ．4 ．1p E G A D —B n a A ．B A N ．a(chǎn) 過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建????????

9、????????2 93 ．4 ．23 5 S ：B n a A ．B A N ．a(chǎn) —G F P 在煙草葉表皮中的亞細(xì)胞定位??????????3 03 ．5 B n a A ．B A N ．a(chǎn) 在甘藍(lán)型油菜中的遺傳轉(zhuǎn)化??????????????????3 03 ．5 ．1 p S B l 3 0 一召h 鰣．B A N ．a(chǎn) 過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建????????????????3 03 ．5 ．2p S B l 3 0 一B n a

10、A ．B A N ．a(chǎn) 干擾載體的構(gòu)建?????????????????3 13 ．5 ．3 甘藍(lán)型油菜的遺傳轉(zhuǎn)化流程????????????????????．．3 33 ．5 ．4T o 代轉(zhuǎn)基因植株的鑒定???????????????????????3 33 ．5 ．5T ．代轉(zhuǎn)基因植株的鑒定???????????????????????3 53 ．5 ．6T 。代轉(zhuǎn)基因植株的多酚類(lèi)物質(zhì)的測(cè)定????????????????．．3

11、6朱寶：B n a A ．B A N ．a(chǎn) 調(diào)控甘藍(lán)型油菜種皮色素成分的研究B n a A ．B A N ．a(chǎn) 調(diào)控甘藍(lán)型油菜種皮色素成分的研究摘要B A N Y U L S ( 脅r ) 是原花青素合成途徑中的重要結(jié)構(gòu)基因，主要編碼花青素還原酶，這種花青素還原酶可以將花青素還原成原花青素。目前，擬南芥中A t B A N 基因在種子類(lèi)黃酮合成途徑中的分子機(jī)理研究得較為清楚，該基因的突變可使擬南芥種皮顏色變淺。但該基因在甘藍(lán)型油菜中功能

12、還未進(jìn)行深入的研究。本實(shí)驗(yàn)基于前期黃、褐籽甘藍(lán)型油菜不同發(fā)育時(shí)期種子的數(shù)字基因表達(dá)譜分析，篩選獲得了黃、褐籽甘藍(lán)型油菜差異表達(dá)基因。我們重點(diǎn)關(guān)注類(lèi)黃酮合成路徑的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)該路徑的多個(gè)基因的表達(dá)量發(fā)生了變化，其中B n B A N 的一個(gè)拷貝在黃籽中發(fā)生明顯下調(diào)表達(dá)。本文擬通過(guò)過(guò)表達(dá)和R N A 干擾等技術(shù)了解甘藍(lán)型油菜中B n B A N 基因?qū)τ筒朔N皮色素成分的影響，為探究甘藍(lán)型油菜種皮色澤變異奠定基礎(chǔ)。通過(guò)生物信息學(xué)的分析發(fā)

13、現(xiàn)B n B A N 基因在甘藍(lán)型油菜中具有四個(gè)拷貝，其中a 、b 拷貝編碼的氨基酸數(shù)目和蛋白的分子量是一致的。通過(guò)對(duì)蕓苔屬作物和擬南芥中B n B A N 基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，發(fā)現(xiàn)B n B A N 基因在蕓苔屬作物和擬南芥中的同源性較高，達(dá)到了8 8 ．7 0 ％。因此，我們對(duì)B n B A N 基因的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究時(shí)可以參照擬南芥中的研究方法。通過(guò)對(duì)甘藍(lán)型油菜中不同組織的q P C R 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)B n a A ．B A N

14、．a(chǎn) 基因在油菜不同組織中的表達(dá)量有明顯差異，在花苞中表達(dá)量最高，而在根中的表達(dá)量最低；通過(guò)對(duì)授粉后3 —6周種子中該基因的q P C R 表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，種子中B n a A ．B A N ．a(chǎn) 基因的表達(dá)量是逐漸上升的，在第6 周基因的表達(dá)量達(dá)到最大值。這樣我們就了解了覷刎．B A N ．a(chǎn) 在不同組織和種子發(fā)育不同時(shí)期的基因表達(dá)模式，為研究上游轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機(jī)制提供了基礎(chǔ)。另外通過(guò)研究砌鰣．B A N ．a(chǎn) 表達(dá)蛋白在煙草中的亞細(xì)胞

15、定位情況，我們發(fā)現(xiàn)B n a A ．B A N ．a(chǎn) 在煙草表皮細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞核中均有熒光，這為研究B n a A ．B A N ．a(chǎn) 編碼的蛋白功能提供一個(gè)細(xì)胞學(xué)上的參考。但是這只是在異源植物中進(jìn)行研究，要準(zhǔn)確確定砌訓(xùn)．B A N ．a(chǎn) 蛋白是在細(xì)胞核與細(xì)胞膜中表達(dá)，還需要在甘藍(lán)型油菜的原生質(zhì)體中進(jìn)行具體研究。。由于甘藍(lán)型油菜中沒(méi)有b a n 突變體，所以本文將采用I ⅢA i 的方法降低甘藍(lán)型油菜中B n a A ．B A N