土壤酶活性測定方法綜合

1、6土壤酶活性測定方法 土壤酶活性測定方法1、土壤脲酶的測定方法（苯酚鈉—次氯酸鈉比色法）一、原理 一、原理脲酶存在于大多數(shù)細菌、真菌和高等植物里。它是一種酰胺酶作用是極為專性的，它僅能水解尿素，水解的最終產(chǎn)物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性，與土壤的微生物數(shù)量、有機物質(zhì)含量、全氮和速效磷含量呈正相關(guān)。根際土壤脲酶活性較高，中性土壤脲酶活性大于堿性土壤。人們常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素狀況。土壤中脲酶活性的測定是以脲素為基質(zhì)經(jīng)酶促反應(yīng)后

2、測定生成的氨量，也可以通過測定未水解的尿素量來求得。本方法以尿素為基質(zhì)，根據(jù)酶促產(chǎn)物氨與苯酚—次氯酸鈉作用生成藍色的靛酚，來分析脲酶活性。二、試劑 二、試劑1）甲苯2）10%尿素：稱取 10g 尿素，用水溶至 100ml。3）檸檬酸鹽緩沖液（PH6.7）：184g 檸檬酸和 147.5g 氫氧化鉀（KOH）溶于蒸餾水。將兩溶液合并，用 1mol/LNaOH 將 PH 調(diào)至 6.7，用水稀釋定容至 1000ml。4）苯酚鈉溶液（1.35m

3、ol/L）：62.5g 苯酚溶于少量乙醇，加 2ml 甲醇和 18.5ml 丙酮，用乙醇稀釋至 100ml（A 液） ，存于冰箱中；27gNaOH 溶于 100ml 水（B 液） 。將 A、B 溶液保存在冰箱中。使用前將 A 液、B 液各 20ml 混合，用蒸餾水稀釋至 100ml。5）次氯酸鈉溶液：用水稀釋試劑，至活性氯的濃度為 0.9%，溶液穩(wěn)定。6）氮的標準溶液： 精確稱取 0.4717g 硫酸銨溶于水并稀釋至 1000ml，得

4、到 1ml 含有0.1mg 氮的標準液；再將此液稀釋 10 倍（吸取 10ml 標準液定容至 100ml）制成氮的工作液（0.01mg/ml） 。三、操作步驟 三、操作步驟稱取 5g 土樣于 50ml 三角瓶中，加 1ml 甲苯，振蕩均勻，15min 后加 10ml10%尿素溶液和 20ml PH 6.7 檸檬酸鹽緩沖溶液，搖勻后在 37℃恒溫箱培養(yǎng) 24 小時。培養(yǎng)結(jié)束后過濾，過濾后取 1ml 濾液加入 50ml 容量瓶中，再加 4m

5、l 苯酚鈉溶液和 3ml 次氯酸鈉溶液，隨加隨搖勻。20min 后顯色，定容。1h 內(nèi)在分光光度計與 578nm 波長處比色。 （靛酚的藍色在 1h 內(nèi)保持穩(wěn)定） 。標準曲線制作：在測定樣品吸光值之前，分別取 0、1、3、5、7、9、11、13ml 氮工作液，移于 50ml 容量瓶中，然后補加蒸餾水至 20ml。再加入 4ml 苯酚鈉溶液和 3ml 次氯酸鈉溶液，隨加隨搖勻。20min 后顯色，定容。1h 內(nèi)在分光光度計上于 578nm

6、 波長處比色。然后以氮工作液濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。注意事項:1、每一個樣品應(yīng)該做一個無基質(zhì)對照，以等體積的蒸餾水代替基質(zhì)，其他操作與樣品實驗相同，以排除土樣中原有的氨對實驗結(jié)果的影響。2、整個實驗設(shè)置一個無土對照，不加土樣，其他操作與樣品實驗相同，以檢驗試劑純度和基質(zhì)自身分解。3、如果樣品吸光值超過標曲的最大值，則應(yīng)該增加分取倍數(shù)或減少培養(yǎng)的土樣四、結(jié)果計算 四、結(jié)果計算： 以 24 小時后 1g 土壤中 NH3－

7、N 的毫克數(shù)表示土壤脲酶活性（Ure） 。Ure=（a 樣品－a 無土－a 無基質(zhì)）×V×n／m式中：a 樣品為樣品吸光值由標準曲線求得的 NH3－N 毫克數(shù)；a 無土為無土對照吸光值由標準曲線求得的 NH3－N 毫克數(shù)；6曲線。注意事項:1、每一個樣品應(yīng)該做一個無基質(zhì)對照，以等體積的蒸餾水代替基質(zhì)，其他操作與樣品實驗相同，以排除土樣中原有的氨對實驗結(jié)果的影響。2、整個實驗設(shè)置一個無土對照，不加土樣，其他操作與樣品實

8、驗相同，以檢驗試劑純度和基質(zhì)自身分解。3、如果樣品吸光值超過標曲的最大值，則應(yīng)該增加分取倍數(shù)或減少培養(yǎng)的土樣四、結(jié)果計算 四、結(jié)果計算 以 24h 后 1g 土壤中釋放出的酚的質(zhì)量（mg）表示磷酸酶活性。磷酸酶活性=（a 樣品－a 無土－a 無基質(zhì)）×V×n／m式中：a 樣品為樣品吸光值由標準曲線求得的酚毫克數(shù)；a 無土為無土對照吸光值由標準曲線求得的酚毫克數(shù)；a 無基質(zhì)為無基質(zhì)對照吸光值由標準曲線求得的酚毫克數(shù)；V

9、 為顯色液體積；n 為分取倍數(shù)，浸出液體積／吸取濾液體積；m 表示烘干土重3、土壤蔗糖酶活性測定（3,5- 二硝基水楊酸比色法）一、原理 一、原理蔗糖酶與土壤許多因子有相關(guān)性，如與土壤有機質(zhì)、氮、磷含量，微生物數(shù)量及土壤呼吸強度有關(guān)，一般情況下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高。蔗糖酶酶解所生成的還原糖與 3,5- 二硝基水楊酸反應(yīng)而生成橙色的 3-氨基-5-硝基水楊酸。顏色深度與還原糖量相關(guān)，因而可用測定還原糖量來表示蔗糖酶的活性。二、

10、試劑 二、試劑1）酶促反應(yīng)試劑：基質(zhì) 8%蔗糖，pH5.5 磷酸緩沖液：1/15M 磷酸氫二鈉（11.876g Na2HPO4·2H2O 溶于 1L 蒸餾水中）0.5ml 加 1/15M 磷酸二氫鉀（9.078g KH2PO4 溶于 1L蒸餾水中）9.5ml 即成，甲苯2）葡萄糖標準液（1mg/mL） 預(yù)先將分析純葡萄糖置 80℃烘箱內(nèi)約 12 小時。準確稱取 50mg 葡萄糖于燒杯中，用蒸餾水溶解后，移至 50mL 容量瓶中

11、，定容，搖勻（冰箱中 4℃保存期約一星期） 。若該溶液發(fā)生混濁和出現(xiàn)絮狀物現(xiàn)象，則應(yīng)棄之，重新配制。 3） 3,5- 二硝基水楊酸試劑（DNS 試劑） 稱 0.5g 二硝基水楊酸，溶于 20ml 2mol/LNaOH 和 50ml 水中，再加 30g 酒石酸鉀鈉，用水稀釋定容至 100ml（保存期不過 7 天） 。三、操作步驟 三、操作步驟（1）標準曲線繪制分別吸 1 mg/mL 的標準葡糖糖溶液 0、0.1、0.2、0.3、0.4、