細(xì)胞活性測(cè)定方法

1、細(xì)胞活性測(cè)定方法細(xì)胞活性測(cè)定方法細(xì)胞活性測(cè)定方法有臺(tái)盼藍(lán)染色法、克隆（集落）形成法、3H放射性同位素?fù)饺敕āTT法等。其中MTT法以其快速簡(jiǎn)便，不需要特殊檢測(cè)儀器、無放射性同位素、適合大批量檢測(cè)的特點(diǎn)而得到廣泛的應(yīng)用。但MTT法形成的Fmazan為水不溶性的，需要加有機(jī)溶劑溶解，由于在去上清操作時(shí)會(huì)有可能帶走小部分的Fmazan，故有時(shí)重復(fù)性略差。為了解決這個(gè)問題，研究人員又開發(fā)了很多種水溶性的四氮唑鹽類：如XTT、CCK8（WST8

2、）等?，F(xiàn)就這三種四氮唑鹽類方法作一個(gè)簡(jiǎn)單介紹：1.MTT法MTT：化學(xué)名：3(4，5二甲基噻唑2)2，5二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍(lán)。檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜（Fmazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。該

3、方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測(cè)定等。它的特點(diǎn)是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)。缺點(diǎn)：由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測(cè)。這不僅使工作量增加，也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，而且溶解甲的有機(jī)溶劑對(duì)實(shí)驗(yàn)者也有損害。2.XTT法XTT：化學(xué)名：23bis(2methoxy4nitro5sulfophenyl)5[(phenylamino)carbonyl]2Htetr

4、azoliumhydroxide，作為線粒體脫氫酶的作用底物，被活細(xì)胞還原成水溶性的橙黃色甲產(chǎn)物。當(dāng)XTT與電子偶合劑（例如PMS）聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，其所產(chǎn)生的水溶性的甲產(chǎn)物的吸光度與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。優(yōu)點(diǎn)：1、使用方便，省去了洗滌細(xì)胞；2、檢測(cè)快速；3、靈敏度高，甚至可以測(cè)定較低細(xì)胞密度；4、重復(fù)性優(yōu)于MTT。缺點(diǎn)：XTT水溶液不穩(wěn)定，需要低溫保存或現(xiàn)配現(xiàn)用。3.CCK8法或稱法或稱WST8法CCK8試劑中含有WST–8：化學(xué)名：2(2甲

5、氧基4硝基苯基)3(4硝基苯基)5(24二磺酸苯)2H四唑單鈉鹽]，它在電子載體1甲氧基5甲基吩嗪硫酸二甲酯（1MethoxyPMS）的作用下被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物（Fmazan）。生成的甲物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。該方法已被廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞增殖試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及藥敏試驗(yàn)等。優(yōu)

6、點(diǎn)：1、使用方便，省去了洗滌細(xì)胞，不需要放射性同位素和有機(jī)溶劑；2、檢測(cè)快速；3、靈敏度高，甚至可以測(cè)定較低細(xì)胞密度；4、重復(fù)性優(yōu)于MTT；5、對(duì)細(xì)胞毒性小；6、為1瓶溶液，毋需預(yù)制，即開即用。缺點(diǎn):1、與MTT相比，CCK8和XTT的價(jià)格比較貴。2、CCK8試劑的顏色為淡紅色，與含酚紅的培養(yǎng)基顏色接近，不注意的話容易產(chǎn)生漏加或多加。三種方法的比較使工作量增加，也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，而且溶解甲的有機(jī)溶劑對(duì)實(shí)驗(yàn)者也有損害。MTT

7、溶液的配制方法溶液的配制方法通常，此法中的MTT濃度為5mgml。因此，可以稱取MTT0.5克，溶于100ml的磷酸緩沖液（PBS）或無酚紅的培養(yǎng)基中，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細(xì)菌，放4℃避光保存即可。在配制和保存的過程中，容器最好用鋁箔紙包住。實(shí)驗(yàn)的時(shí)候我一般關(guān)閉超凈臺(tái)上的日光燈來避光，覺得這樣比較好。需要注意的是，MTT法只能用來檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力，但不能測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)數(shù)。在用酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果的時(shí)候，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的

8、線性，MTT吸光度最好在00.7范圍內(nèi)。MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4℃避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mgml保存在20度長(zhǎng)期保存，避免反復(fù)凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時(shí)候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加，沒必要一下子配那么多，尤其當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時(shí)就絕對(duì)不能再用了。MTT有致癌性，用的時(shí)候小心，有條件最好帶那種透明的簿膜手套。配成的MTT需要無菌，MTT對(duì)菌很敏感；往

9、96孔板加時(shí)不避光也沒有關(guān)系，畢竟時(shí)間較短，或者你不放心的時(shí)候可以把操作臺(tái)上的照明燈關(guān)掉。配制MTT時(shí)用PBS（ph=7.4）溶解。PBS配方：NaCl8g＋KCl0.2g＋Na2HPO41.44g＋KH2PO40.24g調(diào)pH7.4，定容1L。普通普通MTT法實(shí)驗(yàn)步驟：法實(shí)驗(yàn)步驟：1：接種細(xì)胞：用含10％胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔100010000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積200ul。2：培養(yǎng)細(xì)胞：同一般培養(yǎng)條件，

10、培養(yǎng)35天（可根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時(shí)間）。3：呈色：培養(yǎng)35天后，每孔加MTT溶液（5mgml用PBS配制，pH=7.4)20ul。繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150ulDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。4：比色：選擇490nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。藥物藥物MTT法實(shí)驗(yàn)步驟法