細胞活性測定方法

1、細胞活性測定方法細胞活性測定方法細胞活性測定方法有臺盼藍染色法、克?。洌┬纬煞?、3H放射性同位素?fù)饺敕?、MTT法等。其中MTT法以其快速簡便，不需要特殊檢測儀器、無放射性同位素、適合大批量檢測的特點而得到廣泛的應(yīng)用。但MTT法形成的Fmazan為水不溶性的，需要加有機溶劑溶解，由于在去上清操作時會有可能帶走小部分的Fmazan，故有時重復(fù)性略差。為了解決這個問題，研究人員又開發(fā)了很多種水溶性的四氮唑鹽類：如XTT、CCK8（WST8

2、）等。現(xiàn)就這三種四氮唑鹽類方法作一個簡單介紹：1.MTT法MTT：化學(xué)名：3(4，5二甲基噻唑2)2，5二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍。檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲臜（Fmazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)成正比。該

3、方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經(jīng)濟。缺點：由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加，也會對實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，而且溶解甲的有機溶劑對實驗者也有損害。2.XTT法XTT：化學(xué)名：23bis(2methoxy4nitro5sulfophenyl)5[(phenylamino)carbonyl]2Htetr

4、azoliumhydroxide，作為線粒體脫氫酶的作用底物，被活細胞還原成水溶性的橙黃色甲產(chǎn)物。當(dāng)XTT與電子偶合劑（例如PMS）聯(lián)合應(yīng)用時，其所產(chǎn)生的水溶性的甲產(chǎn)物的吸光度與活細胞的數(shù)量成正比。優(yōu)點：1、使用方便，省去了洗滌細胞；2、檢測快速；3、靈敏度高，甚至可以測定較低細胞密度；4、重復(fù)性優(yōu)于MTT。缺點：XTT水溶液不穩(wěn)定，需要低溫保存或現(xiàn)配現(xiàn)用。3.CCK8法或稱法或稱WST8法CCK8試劑中含有WST–8：化學(xué)名：2(2甲

5、氧基4硝基苯基)3(4硝基苯基)5(24二磺酸苯)2H四唑單鈉鹽]，它在電子載體1甲氧基5甲基吩嗪硫酸二甲酯（1MethoxyPMS）的作用下被細胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物（Fmazan）。生成的甲物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比。用酶聯(lián)免疫檢測儀在450nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。該方法已被廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞增殖試驗、細胞毒性試驗以及藥敏試驗等。優(yōu)

6、點：1、使用方便，省去了洗滌細胞，不需要放射性同位素和有機溶劑；2、檢測快速；3、靈敏度高，甚至可以測定較低細胞密度；4、重復(fù)性優(yōu)于MTT；5、對細胞毒性?。?、為1瓶溶液，毋需預(yù)制，即開即用。缺點:1、與MTT相比，CCK8和XTT的價格比較貴。2、CCK8試劑的顏色為淡紅色，與含酚紅的培養(yǎng)基顏色接近，不注意的話容易產(chǎn)生漏加或多加。三種方法的比較使工作量增加，也會對實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，而且溶解甲的有機溶劑對實驗者也有損害。MTT

7、溶液的配制方法溶液的配制方法通常，此法中的MTT濃度為5mgml。因此，可以稱取MTT0.5克，溶于100ml的磷酸緩沖液（PBS）或無酚紅的培養(yǎng)基中，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細菌，放4℃避光保存即可。在配制和保存的過程中，容器最好用鋁箔紙包住。實驗的時候我一般關(guān)閉超凈臺上的日光燈來避光，覺得這樣比較好。需要注意的是，MTT法只能用來檢測細胞相對數(shù)和相對活力，但不能測定細胞絕對數(shù)。在用酶標(biāo)儀檢測結(jié)果的時候，為了保證實驗結(jié)果的

8、線性，MTT吸光度最好在00.7范圍內(nèi)。MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4℃避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mgml保存在20度長期保存，避免反復(fù)凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加，沒必要一下子配那么多，尤其當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時就絕對不能再用了。MTT有致癌性，用的時候小心，有條件最好帶那種透明的簿膜手套。配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感；往

9、96孔板加時不避光也沒有關(guān)系，畢竟時間較短，或者你不放心的時候可以把操作臺上的照明燈關(guān)掉。配制MTT時用PBS（ph=7.4）溶解。PBS配方：NaCl8g＋KCl0.2g＋Na2HPO41.44g＋KH2PO40.24g調(diào)pH7.4，定容1L。普通普通MTT法實驗步驟：法實驗步驟：1：接種細胞：用含10％胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔100010000個細胞接種到96孔板，每孔體積200ul。2：培養(yǎng)細胞：同一般培養(yǎng)條件，

10、培養(yǎng)35天（可根據(jù)試驗?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時間）。3：呈色：培養(yǎng)35天后，每孔加MTT溶液（5mgml用PBS配制，pH=7.4)20ul。繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150ulDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。4：比色：選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細胞生長曲線。藥物藥物MTT法實驗步驟法