新型熒光衍生法測(cè)定細(xì)胞凋亡關(guān)鍵酶活性.pdf

1、細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象,在多細(xì)胞生物去除不需要的或異常的細(xì)胞中起著必要的作用。它在生物體的進(jìn)化、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定以及多個(gè)系統(tǒng)的發(fā)育中起著重要的作用。盡管凋亡過程的詳細(xì)機(jī)制尚不完全清楚,但是已經(jīng)確定Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡過程中是起著必不可少的作用,細(xì)胞凋亡的過程實(shí)際上是Caspase不可逆有限水解底物的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)過程,到目前為止,至少已有14種Caspase被發(fā)現(xiàn),Caspase分子間的同源性很高,結(jié)構(gòu)相似,都是半

2、胱氨酸家族蛋白酶。Caspase酶是細(xì)胞凋亡關(guān)鍵酶,因此其活性檢測(cè)就成為判斷細(xì)胞凋亡程度的重要標(biāo)準(zhǔn)。最近,我們課題組發(fā)現(xiàn)多肽能夠與兒茶酚和高碘酸鈉在pH7.5進(jìn)行縮合反應(yīng),形成單一的熒光產(chǎn)物,激發(fā)最大波長(zhǎng)在390nm附近,發(fā)射波長(zhǎng)在490nm左右。更為重要的是,自由氨基酸、葡萄糖和半乳糖等糖類化合物、精胺等多胺化合物以及DNA堿基如腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶等相同反應(yīng)條件下均不產(chǎn)生熒光。因此,新型熒光衍生方法檢測(cè)caspase酶的

3、活性專屬性強(qiáng),操作簡(jiǎn)便,利于推廣,具有一定的應(yīng)用前景。
　　課題第一部分首先對(duì)寡肽熒光衍生條件進(jìn)行了優(yōu)化,在此基礎(chǔ)上再對(duì)高效液相分析條件進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化后的熒光衍生體系為:供試液100μL,兒茶酚(10mmol/L)100μL,高碘酸鈉(12mmol/L)50μL,硼酸(300mmol/L,pH7.0)50μL,加熱溫度120℃,加熱時(shí)間10min。優(yōu)化后的色譜條件為:色譜柱:CAPCELLPAKC18MGS5(5um,150mm

4、X4.6mmI.D.);流動(dòng)相:A(250mmol/L硼酸,氫氧化鈉調(diào)pH值到7.5,20％):B(水,80-0%):C(甲醇,0-80%)(v/v/v),梯度時(shí)間40min;流速為1.0mL/min;柱溫:30℃;熒光檢測(cè)波長(zhǎng):激發(fā)波長(zhǎng)390nm,發(fā)射波長(zhǎng)490nm;進(jìn)樣量:20μL。
　　課題第二部分用新型熒光衍生方法測(cè)定亮氨酸腦啡肽并與紫外檢測(cè)方法、OPA衍生法進(jìn)行了比較。亮氨酸腦啡肽是一種非常重要的內(nèi)源肽,其氨基酸順序和結(jié)

5、構(gòu)為:酪氨酸-甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu)。體外試驗(yàn)中,保留時(shí)間為25min,線性范圍為0.5～50.0mg/L(r=0.9999),最低定量限為0.25mg/L;模擬血漿實(shí)驗(yàn)中,內(nèi)源物質(zhì)不干擾測(cè)定,線性范圍為0.5～50.0mg/L(r=0.9998),最低定量限為0.5mg/L。血漿中內(nèi)源性干擾物質(zhì)多,紫外檢測(cè)方法和OPA衍生法都不能有效檢測(cè)亮氨酸腦啡肽的含量。
　　課題第三部分是本

6、課題重點(diǎn),利用新型熒光衍生方法來檢測(cè)兩種細(xì)胞系人宮頸癌細(xì)胞(Hela細(xì)胞)和人肺腺癌細(xì)胞(A549細(xì)胞)受誘導(dǎo)凋亡后的caspase-3和caspase-8的活性。每種細(xì)胞系均采用三種誘導(dǎo)凋亡方法:低溫輔助紫外照射誘導(dǎo)凋亡,絲裂霉素C誘導(dǎo)凋亡和喜樹堿誘導(dǎo)凋亡。Caspase酶底物設(shè)計(jì)為在特異識(shí)別序列N端加上具有親水性氨基酸絲氨酸,這可以增加底物水溶性,N端延長(zhǎng)序列同時(shí)能增加底物專屬性,C端加上實(shí)驗(yàn)證明衍生效率較高的兩種寡肽片段LG和AL