酶活性濃度的測(cè)定測(cè)定酶的催化活性濃度是臨床酶學(xué)分析最為常用

1、第四節(jié) 酶活性濃度的測(cè)定技術(shù)一、概 述1．量氣法：　 此法很少采用。 2．分光光度法： 其最大優(yōu)點(diǎn)在于擴(kuò)大了測(cè)定范圍，波長(zhǎng)范圍更寬。結(jié)合各種工具酶的偶聯(lián)反應(yīng)，如應(yīng)用NAD(P)H和NAD(P)+吸收光譜差異建立的測(cè)定各種脫氫酶活性濃度的方法，使分光光度法得到了進(jìn)一步發(fā)展，幾乎可應(yīng)用于各種血清酶活性的測(cè)定。隨著各種自動(dòng)生物化學(xué)儀和配套用試劑盒的普及應(yīng)用，這一方法在臨床酶學(xué)測(cè)定中起著十分重要的作用。,3．熒光法和放射

2、性核素法: 對(duì)于一些酶濃度很低的標(biāo)本，可考慮改用靈敏度較高的熒光法或放射性核素法。熒光法取決于酶促反應(yīng)生成熒光物質(zhì)的速率，此速率與酶濃度成正比，并通過(guò)熒光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)熒光強(qiáng)弱的變化換算出酶的活性。例如，還原型的NAD(P)H有強(qiáng)烈的熒光，故所有以NAD(P)+為輔酶的氧化還原酶類均可用熒光法進(jìn)行測(cè)定。核素法因有污染且操作煩雜，目前應(yīng)用較少。 4．其他方法:,二、酶活性濃度的測(cè)定

3、 測(cè)定酶的催化活性濃度是臨床酶學(xué)分析最為常用的方法，具有迅速、靈敏、成本低等特點(diǎn)?？筛鶕?jù)酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線，采用合理的方法進(jìn)行酶活性濃度的測(cè)定。,(一) 酶促反應(yīng)進(jìn)程,(二) 酶活性濃度測(cè)定方法 酶活性濃度測(cè)定就是要使酶促反應(yīng)的初速度(v) 達(dá)到最大速度Vmax，即在過(guò)量底物存在下的零級(jí)反應(yīng)期的速度，此時(shí)反應(yīng)速度與酶濃度 [E]之間有線性關(guān)系。如按反應(yīng)時(shí)間將酶活性濃度測(cè)定方法進(jìn)行分類，可分為定時(shí)法(fixe

4、d time assay)和連續(xù)監(jiān)測(cè)法(continuous monitoring assay)兩大類。,1．定時(shí)法 這是早期測(cè)定酶活性濃度的方法。 大多是使酶作用一段時(shí)間，然后加入強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、蛋白沉淀劑等終止酶促反應(yīng)，測(cè)定這段時(shí)間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的生成量，計(jì)算酶促反應(yīng)平均速度。這類方法有多種命名，如“取樣法”、“終點(diǎn)法”或“兩點(diǎn)法”。,用定時(shí)法測(cè)定酶活性濃度，必須保證酶和底物在所選定的溫度下作用時(shí)間要很精確，否則會(huì)

5、引起較大誤差。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是比較簡(jiǎn)單，因測(cè)定時(shí)酶促反應(yīng)已被終止，故比色計(jì)或分光光度計(jì)無(wú)需保溫設(shè)備，顯色劑的選擇也可不考慮對(duì)酶活性的影響。缺點(diǎn)是無(wú)法知道在整個(gè)酶促反應(yīng)進(jìn)程中是否都是零級(jí)反應(yīng)。,,,2．連續(xù)監(jiān)測(cè)法 連續(xù)測(cè)定酶反應(yīng)過(guò)程中某一反應(yīng)產(chǎn)物或底物的濃度隨時(shí)間變化的多點(diǎn)數(shù)據(jù)，求出酶反應(yīng)初速度，間接計(jì)算酶活性濃度的方法稱為連續(xù)監(jiān)測(cè)法。,,,2．連續(xù)監(jiān)測(cè)法 連續(xù)測(cè)定酶反應(yīng)過(guò)程中某一反應(yīng)產(chǎn)物或底物的濃度隨時(shí)間

6、變化的多點(diǎn)數(shù)據(jù)，求出酶反應(yīng)初速度，間接計(jì)算酶活性濃度的方法稱為連續(xù)監(jiān)測(cè)法。與定時(shí)法不同的是，這類方法勿需停止酶促反應(yīng)，不需添加其他呈色試劑，就可測(cè)定反應(yīng)物的變化，很容易觀察到反應(yīng)的整個(gè)過(guò)程。,這類測(cè)定方法簡(jiǎn)單，優(yōu)點(diǎn)是可將多點(diǎn)的測(cè)定結(jié)果連接成線，很容易找到成直線的區(qū)段，可以觀察到是否偏離零級(jí)反應(yīng)，因而可選擇線性反應(yīng)期來(lái)計(jì)算酶活性，不需終止反應(yīng)。通常截取反應(yīng)開(kāi)始后較短的時(shí)間，就能近似地建立這種反應(yīng)量與反應(yīng)時(shí)間的線性關(guān)系，不過(guò)這種時(shí)間范圍因酶

7、種類和反應(yīng)條件而異，必須用實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行確定。,連續(xù)監(jiān)測(cè)法,連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定結(jié)果常較定時(shí)法高，且因在酶促反應(yīng)初始階段底物最充裕，而產(chǎn)物的抑制作用、可逆反應(yīng)、酶變性等均很小，因而測(cè)定結(jié)果也較取樣法準(zhǔn)確。,3．平衡法 通過(guò)測(cè)定酶促反應(yīng)開(kāi)始至反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)產(chǎn)物或底物濃度的總變化量來(lái)求出酶活性濃度的方法，稱為終點(diǎn)法。與定時(shí)法不同的是，平衡法是在酶促反應(yīng)平衡期([S]或[P]不變)任何一點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定，無(wú)需終止反應(yīng)。目前此法已少使用。,三、

8、連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定酶活性濃度 隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步與發(fā)展，各種自動(dòng)生物化學(xué)分析儀的廣泛使用，連續(xù)監(jiān)測(cè)法已逐步取代定時(shí)法而成為臨床實(shí)驗(yàn)室測(cè)定酶活性濃度最常用的方法。 (一)連續(xù)監(jiān)測(cè)法的種類1．直接法 2. 間接法,1．直接法 這類方法是在不終止酶促反應(yīng)條件下，直接通過(guò)測(cè)定反應(yīng)體系中底物或產(chǎn)物理化特性的變化如吸光度、熒光、旋光性、pH、電導(dǎo)率、粘度等，從而計(jì)算出酶活性濃度。其中以分光光度法應(yīng)用最為廣泛，也是

9、方法學(xué)上最成熟的一種。,利用NAD(P)H在340nm處的吸光度的變化測(cè)定各種脫氫酶的方法是應(yīng)用最廣的一類方法。NAD(P)H在260nm波長(zhǎng)和340nm波長(zhǎng)處有吸收峰，而氧化型NAD+／NADP+只在260nm波長(zhǎng)處有吸收峰，這是因?yàn)榉肿又杏邢汆堰实木壒省?40nm波長(zhǎng)處吸光度的變化可以反映反應(yīng)體系中NAD(P)H量的增減。還可利用一類人工合成的所謂“色素原”底物，其本身為無(wú)色或微黃色，酶作用后生成有色化合物，如目前應(yīng)用硝基苯酚和硝基

10、苯胺的衍生物進(jìn)行水解酶和一些還原酶的測(cè)定。,2. 間接法 直接法雖然簡(jiǎn)單，但只有底物與產(chǎn)物之間，在理化性質(zhì)等方面有顯著差異時(shí)，才能使用直接法。故至今也只有很少一部分酶能用直接法進(jìn)行測(cè)定。目前可采用兩類間接法進(jìn)行酶學(xué)測(cè)定。,一類方法是在原來(lái)反應(yīng)體系中加入一些試劑，這些試劑只和酶反應(yīng)物迅速作用，產(chǎn)生可被儀器檢出的物質(zhì)變化，但同時(shí)又不和酶作用也不影響酶活性。典型的例子是血清ChE的丁酰硫代膽堿測(cè)定法。 另一類是目前應(yīng)用最

11、多，最為廣泛的酶偶聯(lián)法，即在原反應(yīng)體系中加入另一些酶試劑，所進(jìn)行的酶促反應(yīng)和被測(cè)酶反應(yīng)偶聯(lián)起來(lái)。,(二)酶偶聯(lián)反應(yīng) 最簡(jiǎn)單的酶偶聯(lián)反應(yīng)(單底物反應(yīng)且只有一個(gè)工具酶)模式為：,被測(cè)定酶(Ex)催化的反應(yīng)稱為始發(fā)反應(yīng)；產(chǎn)生被檢測(cè)物質(zhì)產(chǎn)物C(如NADH)的反應(yīng)稱為指示反應(yīng)，相應(yīng)的偶聯(lián)酶(第二個(gè)酶)酶稱指示酶(Ei)。,如果一些酶促反應(yīng)找不到合適的指示酶與其直接偶聯(lián)，此時(shí)往往還可在始發(fā)反應(yīng)和指示反應(yīng)之間加入另一種酶，將二者連接起來(lái)，

12、此反應(yīng)稱為輔助反應(yīng)。模式為：,一般習(xí)慣將最后一個(gè)酶稱指示酶Ei，其他外加的酶稱為輔助酶(Ea)。個(gè)別情況還可能使用兩種或以上的輔助酶。將這一連串酶促反應(yīng)稱為酶偶聯(lián)體系。,臨床常規(guī)酶學(xué)分析所用的酶偶聯(lián)法中，多以脫氫酶為指示酶。通過(guò)監(jiān)測(cè)其反應(yīng)物NADH或NADPH于340nm處吸光度的變化速率，可以很容易地監(jiān)測(cè)指示酶反應(yīng)。,用酶偶聯(lián)法測(cè)定酶活性濃度時(shí)，并不是一開(kāi)始反應(yīng)就全部反映了測(cè)定酶活性。這是因?yàn)樵谂悸?lián)反應(yīng)中存在幾個(gè)時(shí)相：一是預(yù)孵育期，反

13、應(yīng)一開(kāi)始只存在底物 A，不存在指示酶的反應(yīng)，在此時(shí)相中使存在于樣品中的干擾物質(zhì)充分進(jìn)行反．應(yīng)，將試劑中的NADH變?yōu)镹AD+。二是延滯期，加入底物啟動(dòng)反應(yīng)，在啟動(dòng)后的一段短時(shí)間內(nèi)，產(chǎn)物 B開(kāi)始出現(xiàn)并逐漸增加，處于較低水平，指示酶反應(yīng)速度也較低，不能代表測(cè)定酶的反應(yīng)速率Vx，這一時(shí)期稱為延滯期。隨著產(chǎn)物B增加到一定程度時(shí)，Ex和 Ei反應(yīng)速率相同，達(dá)到了穩(wěn)態(tài)期。此階段 340nm波長(zhǎng)處吸光度才會(huì)有明顯的線性變化。最后由于底物消耗，反應(yīng)速度

14、又復(fù)減慢。,設(shè)計(jì)或選擇酶測(cè)定方法時(shí)，如用酶偶聯(lián)法，延滯期越短越好，測(cè)定時(shí)間一定要避開(kāi)此期。,為了保證準(zhǔn)確測(cè)定酶活性，酶偶聯(lián)反應(yīng)的反應(yīng)速率應(yīng)超過(guò)或等于測(cè)定酶的反應(yīng)速率，指示酶反應(yīng)必須是一級(jí)反應(yīng)，即指示酶反應(yīng)速率應(yīng)和測(cè)定酶的產(chǎn)物 B濃度成正比。只有當(dāng)使用大量的指示酶，以及指示酶的Km很小時(shí)，才能做到這一點(diǎn)。一般說(shuō)來(lái)酶偶聯(lián)法中所用的指示酶 Km值都很小，酶促反應(yīng)最適pH應(yīng)與工具酶的反應(yīng)最適 pH 相接近。當(dāng)然在選用指示酶時(shí)還應(yīng)從

15、經(jīng)濟(jì)方面考慮選用一些來(lái)源容易且價(jià)格便宜的酶制劑。,(三)干擾因素 臨床測(cè)定酶活性濃度標(biāo)本都是體液，其中除測(cè)定酶外，還存在著其他各種酶和其他物質(zhì)，因此在實(shí)測(cè)反應(yīng)中可能出現(xiàn)一些副反應(yīng)或旁路反應(yīng)，這些都會(huì)對(duì)測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)生干擾。,1．其他酶和物質(zhì)的干擾 反應(yīng)體系各成分除可能引起測(cè)定酶反應(yīng)外，還有可能引起其他酶的反應(yīng)而干擾測(cè)定。例如酶偶聯(lián)法測(cè) ALT時(shí)，由于反應(yīng)體系中含有大量NADH和LD，可與血液標(biāo)本中所含丙酮酸

16、反應(yīng)，引起 340 nm波長(zhǎng)處吸光度下降，從而引起ALT活性測(cè)定誤差。,2．酶的污染 因試劑用酶多從動(dòng)物組織或細(xì)菌中提取，易污染其他酶，如不設(shè)法除去將引起測(cè)定誤差。如組織勻漿中往往含有NADH-細(xì)胞色素C還原酶，它將干擾各種還原酶的測(cè)定。使用的酶制劑(如工具酶)必須提純。例如測(cè)AST時(shí)，被蘋(píng)果酸脫氫酶所污染的AST不應(yīng)超過(guò)相對(duì)量的5x10-5(0.005％)。,3．非酶反應(yīng) 有些底物不穩(wěn)定，沒(méi)有酶的作用就會(huì)

17、自行反應(yīng)。例如很多硝基酚的酯類衍生物在水溶液中不穩(wěn)定，放置一段時(shí)間可自行水解釋放出硝基酚。類似情況還可見(jiàn)于一些內(nèi)部因素如pH變化而引起的空白對(duì)照的變化。又如測(cè)定ALD時(shí)，其底物醛類化合物可以和NAD+起非酶反應(yīng)產(chǎn)生一種具有類似NADH的吸收光譜的衍生物，給測(cè)定帶來(lái)困難。,4．分析容器的污染 如分析容器或管道污染而混雜有其他一些物質(zhì)，可能影響酶的活性。如微量重金屬可使酶失活，殘留的表面活性劑可能抑制酶活性。,5．沉

18、淀形成 使用分光光度法測(cè)定酶活性時(shí)，如有沉淀形成或組織勻漿中顆粒的下沉都會(huì)引起吸光度變化。常加入表面活性劑以防止顆粒從勻漿中析出。有些酶反應(yīng)需鎂離子作為輔因子，如反應(yīng)液中含有多余磷酸根時(shí)將有沉淀出現(xiàn)。,解決上述干擾問(wèn)題的方法之一可通過(guò)試劑空白管檢出并加以校正。即有時(shí)不僅要作標(biāo)本對(duì)照管，還要作試劑空白管。另一個(gè)有效途徑就是不用單一試劑而改用雙試劑測(cè)定酶活性。,四、工 具 酶 通常把酶學(xué)分析中作為試

19、劑用于測(cè)定化合物濃度或酶活性濃度的酶稱為工具酶。常使用酶偶聯(lián)體系進(jìn)行測(cè)定，指示酶和輔助酶作為反應(yīng)系統(tǒng)中的試劑。,(一) 常用工具酶及其質(zhì)量要求 常用工具酶多為氧化還原酶類，這是因?yàn)槠洚a(chǎn)物最易被直接監(jiān)測(cè)而成為指示酶。在一系列利用工具酶的反應(yīng)中，主要限速因子應(yīng)該是待測(cè)化合物和待測(cè)酶，工具酶和其輔助底物應(yīng)過(guò)量。,(二)工具酶參與的指示反應(yīng) 近年來(lái)，在臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)中，許多項(xiàng)目的測(cè)定往往使用有工具酶的參與的類似的反應(yīng)

20、原理，即所謂共通(或通用)反應(yīng)途徑。,最常用的有兩類分光光度法： 一類是利用較高特異性的氧化酶產(chǎn)生過(guò)氧化氫(H2O2)，再加氧化發(fā)色劑比色； 一類是利用氧化-還原酶反應(yīng)使其連接到NAD(P)—NAD(P)H的正／逆反應(yīng)后，直接通過(guò)分光光度法或其他方法測(cè)定NAD(P)H的變化量。,1．偶聯(lián)H202的工具酶及其指示反應(yīng) 臨床化學(xué)測(cè)定中，可利用葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶等工具酶分別用于葡萄糖、尿酸的測(cè)定，

21、可使相應(yīng)底物被氧化生成H202。H202主要通過(guò)以氫(或電子)為受體的指示酶和以NAD(P)H為輔酶參與的兩類指示反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。前者主要有兩類工具酶參與反應(yīng)：過(guò)氧化氫酶或稱觸酶(catalase)及過(guò)氧化物酶(peroxidase,POD)，兩者均為含三價(jià)鐵的指示酶。以指示酶POD最為常用，主要催化以下兩種反應(yīng)。,一種是在POD的直接催化下，H202氧化芳香族胺色素原生成有色的色素，此類色素原供氫體有鄰聯(lián)甲苯胺(OT)、聯(lián)苯胺(DAB)

22、、鄰聯(lián)茴香胺(ODA)和3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)。其中只有TMB無(wú)致癌性，且其生色的靈敏度最高。,2．NAD(P)+或NAD(P)H偶聯(lián)的 脫氫酶及其指示反應(yīng) 許多氧化還原反應(yīng)，尤其是作為工具酶的脫氫酶如LD、GLD、G6PD等參與時(shí)，常將底物的氫原子去除后傳遞給NAD(P)+而形成NAD(P)H。LD主要以NAD+／NADH為輔酶，而GLD則不論來(lái)自肝或細(xì)菌，均可以NAD+／NAD

23、P+或其還原型為輔酶。因NAD(P)H在340nm有特征性光吸收，可借此用分光光度法進(jìn)行檢測(cè)。目前利用此類反應(yīng)的測(cè)定項(xiàng)目至少有葡萄糖、尿素、β-羥丁酸、甘油三酯、甲醇、血氨、ALT、AST、LD、GLD、CK、ALD、G6PD和lCD等。,為了簡(jiǎn)化操作過(guò)程，并使酶試劑得以方便或反復(fù)使用，已有許多研究將水溶性的酶通過(guò)吸附、包埋、載體共價(jià)結(jié)合或通過(guò)酶分子間共價(jià)交聯(lián)等方法固定在支持物上，并保持其原有的活性，這樣制備的酶稱為固相酶(或固定酶)(

24、immobilized enzyme)。近些年來(lái)，固相酶技術(shù)發(fā)展迅速，特別是固相酶膜的應(yīng)用使臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)進(jìn)入了干化學(xué)的時(shí)代，一些測(cè)定變得更加方便、快速。酶電極、酶探針等也在不斷研制開(kāi)發(fā)中，相信此類技術(shù)將成為臨床生物化學(xué)發(fā)展的一個(gè)新方向。,五、血清酶活性濃度測(cè)定條件的優(yōu)化 測(cè)定酶活性濃度方法所選擇的測(cè)定條件應(yīng)是酶促反應(yīng)的“最適條件”，即指在所選擇溫度下能使酶促反應(yīng)的催化活性達(dá)到最大所需的條件。,最適條件主要與下述一

25、些因素有關(guān)： (1)底物、輔因子、激活劑、緩沖液和變構(gòu)劑種類和濃度； (2)指示酶和輔助酶的種類和濃度； (3)反應(yīng)混合液的pH和離子強(qiáng)度； (4)其他可變因素，如已知抑制劑的去除。 在某些情況下，為了使最終測(cè)定系統(tǒng)達(dá)到最大的測(cè)定重復(fù)性，可考慮對(duì)最適條件進(jìn)行適當(dāng)修改。,(一)方法選擇 應(yīng)盡可能全部采用連續(xù)監(jiān)測(cè)法，少用或不用定時(shí)法。盡量減少操作步驟，以避免過(guò)多的吸量和接觸

26、太多的容器表面而引起的誤差。,(二)儀器和設(shè)備 應(yīng)明確規(guī)定儀器和設(shè)備的各種性能規(guī)范，推薦使用性能符合要求或經(jīng)檢定合格的分光光度計(jì)、半自動(dòng)或全自動(dòng)生物化學(xué)分析儀及其他相應(yīng)的配套設(shè)備。任何接觸標(biāo)本、試劑或反應(yīng)混合物的表面都必須經(jīng)化學(xué)清洗，去除干擾酶活性測(cè)定的一些物質(zhì)，如極少量的酸、金屬、去垢劑或其他復(fù)合物等。,(三) 試劑 化學(xué)試劑必須具有一定純度，不含影響反應(yīng)速度的雜質(zhì)。試驗(yàn)用水最好是純水或雙蒸水。

27、如果水中存在酶的抑制劑，其濃度應(yīng)低于最小抑制濃度。如所配制試劑需保存較長(zhǎng)時(shí)間，則應(yīng)使用無(wú)菌水。選用符合臨床實(shí)驗(yàn)室要求的試劑，建議用液體雙試劑。,(四)自動(dòng)生物化學(xué)分析儀參數(shù)的設(shè)置 方法中應(yīng)詳細(xì)列出測(cè)定酶催化濃度的全部操作過(guò)程?？蓞⒖純x器及試劑給出的方法和參數(shù)進(jìn)行設(shè)置。,1．方法類型 定時(shí)法或連續(xù)監(jiān)測(cè)法。反應(yīng)方向分正向／向上／+(吸光度增加)或負(fù)向／向下/-(吸光度減低)。如ALT、AST測(cè)定選用負(fù)向反應(yīng)。

28、,2．波長(zhǎng) 選擇酶促反應(yīng)體系吸光度最大的波長(zhǎng)，如用雙波長(zhǎng)應(yīng)寫(xiě)明主波長(zhǎng)／次波長(zhǎng)。因雙波長(zhǎng)能有效消除干擾的影響，故常被采用。,3．樣品量與試劑量 應(yīng)考慮測(cè)定的靈敏度和測(cè)定上限選用合適的樣品與試劑體積比。一般推薦樣品與試劑體積比為1：10。如樣品所占比例過(guò)小會(huì)降低靈敏度，樣品量過(guò)大，則測(cè)定線性下降，樣品要稀釋后復(fù)檢的機(jī)會(huì)增多。,4．稀釋水量 添加樣品稀釋水的目的是為了洗出粘附在采樣針內(nèi)壁上的微

29、量血清，減少加樣誤差。添加試劑稀釋水是為了避免試劑間的交叉污染。兩種稀釋水的量應(yīng)在復(fù)溶試劑時(shí)按比例扣除。如用液體試劑盒時(shí)因不再加水，無(wú)法扣除稀釋水量，所以兩種稀釋水的量應(yīng)盡量減少，以免試劑被過(guò)量稀釋。,5．反應(yīng)時(shí)間 觀察反應(yīng)進(jìn)程曲線測(cè)出預(yù)孵育時(shí)間、延遲時(shí)間及連續(xù)監(jiān)測(cè)時(shí)間，求出反應(yīng)線性時(shí)間范圍。線性反應(yīng)時(shí)間范圍越寬者，越適用于臨床應(yīng)用。,6．孵育時(shí)間 葡萄糖、總膽固醇、甘油三酯等都采用酶法的Tr

30、inder反應(yīng)進(jìn)行測(cè)定，但37℃酶反應(yīng)較慢，必須測(cè)定這些酶試劑反應(yīng)達(dá)到終點(diǎn)的時(shí)間。自動(dòng)分析儀用試劑盒一般可以在全部加樣后5min內(nèi)反應(yīng)完全，所以應(yīng)選擇分析儀的最大反應(yīng)時(shí)間。,7．延遲時(shí)間 酶與底物混合后需要一定的時(shí)間讓酶被激活，直至線性反應(yīng)期才能開(kāi)始監(jiān)測(cè)，有的項(xiàng)目需要用工具酶將內(nèi)源性代謝產(chǎn)物耗盡。一般單試劑法只需30s，常用項(xiàng)目中ALT、AST與CK-NAC需要特別注意。,8．監(jiān)測(cè)時(shí)間 測(cè)酶的連續(xù)監(jiān)測(cè)法至少

31、90～120s或至少4點(diǎn)(3個(gè)△A)，少于3個(gè)△A不能稱為連續(xù)監(jiān)測(cè)法，因?yàn)椴荒苡?jì)算線性度(不知是否為線性反應(yīng))。監(jiān)測(cè)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則容易發(fā)生底物耗盡，可測(cè)范圍變窄。,9．試劑吸光度上、下限 試劑吸光度上限為正向反應(yīng)用，可參考試劑盒說(shuō)明書(shū)要求數(shù)值折算成所用比色杯的光徑。如試劑盒要求上限為 0.5，比色杯光徑 0.7cm 者設(shè)置0.35。試劑吸光度下限為負(fù)向反應(yīng)用。設(shè)置法同上，如ALT試劑吸光度下限為1.2。0.7cm比色杯設(shè)置0.

32、8。,10．底物耗盡限額 不同型號(hào)分析儀的設(shè)計(jì)不一樣。有的為零點(diǎn)與監(jiān)測(cè)第一點(diǎn)吸光度的差額；有的為MAX OD／MIN OD，即吸光度上升或下降至指定吸光度的數(shù)值；超過(guò)限額說(shuō)明樣品的酶活性非常高，底物將要耗盡，隨后監(jiān)測(cè)的吸光度已不可靠，不打印結(jié)果而只打印出底物耗盡警號(hào)，樣品應(yīng)稀釋5—10倍重測(cè)。,11．線性度 線性度百分?jǐn)?shù)大，說(shuō)明△A之間已不成線性；或?yàn)楦鱾€(gè)讀數(shù)點(diǎn)最小二乘法的均方差限額。超過(guò)限額說(shuō)明底物不足，檢

33、測(cè)結(jié)果會(huì)變低，打印警號(hào)，應(yīng)稀釋后重測(cè)。一般設(shè)15％，線性度限額定義見(jiàn)相關(guān)儀器說(shuō)明書(shū)。各測(cè)試點(diǎn)最小二乘法的均方差限額計(jì)算法見(jiàn)儀器說(shuō)明書(shū)。,12．試劑空白速率 試劑在監(jiān)測(cè)過(guò)程中底物自動(dòng)降解得到的結(jié)果。此結(jié)果會(huì)在樣品測(cè)定結(jié)果中自動(dòng)扣除。,13．線性范圍 按試劑質(zhì)量而設(shè)置，超過(guò)范圍應(yīng)增加樣品量或稀釋后重測(cè)。不同試劑公司的試劑質(zhì)量不一，不同樣品試劑比的線性范圍也不一樣，應(yīng)實(shí)測(cè)試劑盒的線性范圍。終點(diǎn)法可配制系列濃度的標(biāo)

34、準(zhǔn)液，按分析項(xiàng)目的波長(zhǎng)、樣品量與試劑量、孵育時(shí)間，測(cè)定各濃度的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在線性內(nèi)的最高濃度為線性上限。,14．計(jì)算因子F值(或系數(shù)K) 計(jì)算方法詳見(jiàn)“系數(shù)K值的計(jì)算與應(yīng)用”部分內(nèi)容。凡屬吸光度下降的指示反應(yīng)，F(xiàn)為負(fù)數(shù)，如測(cè)定NADPH為輔酶的各種還原酶。,(五)標(biāo)本的采集、運(yùn)輸與保存的技術(shù)誤差因素　　1．溶血 　　大部分酶在細(xì)胞內(nèi)外濃度差異明顯，且其活性遠(yuǎn)高于血清，少量血細(xì)胞的破壞就可能引起

35、血清中酶明顯升高。如紅細(xì)胞內(nèi)的LD、AST和ALT活性分別較血清中高150、15和7倍左右，故測(cè)定這些酶時(shí)，樣品應(yīng)避免溶血。,靜脈采血后，必須在1-2h內(nèi)及時(shí)離心，將血清與血細(xì)胞、血凝塊分離，以免血細(xì)胞中的酶通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入血清而引起誤差。血細(xì)胞被分離后，因血中C02喪失極快，可使pH在15min內(nèi)由7.4增至8.0，對(duì)堿性敏感的ACP活性因而急劇下降。應(yīng)避免因抽血不當(dāng)或急于分離血清而引起的體外溶血。,2.抗凝劑

36、 草酸鹽、枸櫞酸鹽和EDTA等抗凝劑為金屬螯合劑，可抑制需要Ca2+的AMY，也可抑制需Mg2+的CK和5’-NT；草酸鹽既可與丙酮酸或乳酸發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制，又能與LD或NADH或NAD+形成復(fù)合物，從而抑制催化的還原或氧化反應(yīng)。枸櫞酸鹽、草酸鹽對(duì)CP、ChE均有抑制作用；EDTA還能抑制ALP；氟化物也可抑制ChE。故用上述抗凝劑分離之血漿一般不宜做酶活性測(cè)定。,肝素是粘多糖，對(duì)ALT、AST、CK、LD和ACP無(wú)影響，適于急診時(shí)迅速

37、分離血漿進(jìn)行測(cè)定，但需注意的是對(duì)CK等酶有輕微抑制作用。為避免上述影響，臨床上除非測(cè)定與凝血或纖溶有關(guān)的酶活性，一般都不采用血漿而采用血清為首選測(cè)定樣品。,3．溫度 血清蛋白對(duì)酶蛋白有穩(wěn)定作用，如無(wú)細(xì)菌污染，某些酶(如 AST、γ-GT和ALP等)存在于清蛋白中，可在室溫保存l～3天，而活性不受影響。故室溫中較穩(wěn)定的酶類甚至可快速郵件送檢；有些酶極不穩(wěn)定，如血清前列腺ACP，在37℃放置1h，活性可下降50％。大部分酶在低

38、溫中比較穩(wěn)定，一般至少應(yīng)在血清分離后的當(dāng)天進(jìn)行測(cè)定，否則應(yīng)放冰箱冷藏。,通常測(cè)定酶樣品應(yīng)在低溫(0～4℃)條件下使用、處理和保存，但有些酶在低溫(特別是20℃冰凍)時(shí)，可引起不可逆性失活(如ALD)。個(gè)別酶如LD及其同工酶(LD4和LD5)在低溫反而不如室溫穩(wěn)定，即所謂“冷變性”。用液氮貯樣法保存人的血清于-195℃中，常用診斷酶ALT、AST、ALP、CK、LD、γ-GT和AMY活性，在10個(gè)月后活性基本無(wú)明顯改變?？勺鳛槊笇W(xué)測(cè)定用血

39、清標(biāo)本及質(zhì)控品長(zhǎng)期保存的方法。,六、酶活性濃度的單位(一)酶活性單位 1．慣用單位 二十世紀(jì)50年代以前酶活性單位命名混亂，常用首先報(bào)告該種酶測(cè)定方法的臨床酶學(xué)家的名字來(lái)命名其單位，不僅酶不同，單位不同，即使是同一種酶也因方法不同而可有數(shù)種活性單位，參考值差別也很大，既引起混亂，又不便于互相進(jìn)行比較，給臨床實(shí)際工作帶來(lái)很大不便。,2．國(guó)際單位 1963年國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)推薦采用國(guó)際單位來(lái)統(tǒng)一表示酶活性的大小，即在25

40、℃及其他最適條件下，每分鐘能催化一微摩爾底物轉(zhuǎn)變的酶量為一個(gè)國(guó)際單位。 到1976年對(duì)酶活性單位的定義為：在特定的條件下，一分鐘內(nèi)使底物轉(zhuǎn)變一微摩爾的酶量為一個(gè)國(guó)際單位。以IU表示之，IlU=1μmol·min-1。由于未指定酶反應(yīng)溫度，目前國(guó)內(nèi)外大多數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)室常省略國(guó)際二字，即常將IU簡(jiǎn)寫(xiě)為U。,3．Katal單位 1979年國(guó)際生物化學(xué)協(xié)會(huì)為了使酶活性單位與國(guó)際單位制(S1)的反應(yīng)速率相一致，推薦用

41、Katal單位(也稱催量，可簡(jiǎn)寫(xiě)為Kat)。即在規(guī)定條件下，每秒鐘催化轉(zhuǎn)化一摩爾底物的酶量。lkatal=lmol·s-1。我國(guó)法定計(jì)量單位制中的酶催化活性單位為katal，其對(duì)血清中酶量而言顯然過(guò)大，故常用單位為μkatal或nkatal。lkatal=60x 106 U，1U=1μmol· min-1=16.67nmol·s-1=16.67nkatal。,(二)酶活性濃度單位 臨床上測(cè)定的不是酶的

42、絕對(duì)量而是濃度。酶活性濃度以每單位體積所含的酶活性單位數(shù)表示。1．表示方法 目前在臨床化學(xué)中，各國(guó)學(xué)者幾乎都習(xí)慣用U／L來(lái)表示體液中酶催化濃度。,2．酶活性濃度單位的計(jì)算 可根據(jù)所測(cè)定的酶所用方法的不同，利用標(biāo)準(zhǔn)管法、標(biāo)準(zhǔn)曲線法或摩爾消光系數(shù)法進(jìn)行計(jì)算求取酶活性濃度單位。前兩種方法目前已較少使用。,用連續(xù)監(jiān)測(cè)法進(jìn)行酶活性測(cè)定時(shí)，不需作標(biāo)準(zhǔn)管或標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)摩爾消光系數(shù)很容易進(jìn)行酶活性濃度的計(jì)算。摩爾消光系數(shù)(ε)的定義為

43、：在特定條件下，一定波長(zhǎng)的光，光徑為1.00cm時(shí)，通過(guò)所含吸光物質(zhì)的濃度為1.00 mol／L時(shí)的吸光度。如用連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定在線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的變化(△A／min)，以U／L表示酶活性濃度時(shí)，則可按下式進(jìn)行計(jì)算： U/L=,式中：V一反應(yīng)體系體積(ml) ε一摩爾消光系數(shù)(cm2·mol-1) v一樣品量(ml) L一比色杯光徑(cm) △A一吸

44、光度變化 106一將mol換算成μmol,(三)參考值和正常上限倍數(shù)的應(yīng)用 1．參考值 由于臨床實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行酶學(xué)測(cè)定時(shí)所選儀器、試劑和方法不同，加之生物學(xué)變異等對(duì)酶活性影響，常常導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室之間所得參考值差別甚遠(yuǎn)，應(yīng)根據(jù)各自情況對(duì)各種酶建立自己的參考值。對(duì)儀器廠家所提供的資料、市售試劑盒的說(shuō)明書(shū)等所給出的參考數(shù)值，都應(yīng)經(jīng)過(guò)實(shí)際驗(yàn)證和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，方能決定是否采用，切莫輕易加以接受。表6-6列舉了幾種臨床常用酶的成人參考值。,2

45、．正常上限倍數(shù)的應(yīng)用 近來(lái)有不少學(xué)者建議，在分析酶學(xué)報(bào)告時(shí)，不應(yīng)局限傳統(tǒng)測(cè)定的報(bào)告方式(U／L)，而改以正常上限(upper limits of normal，ULN)倍數(shù)作為酶活性濃度的表示法。,所謂正常上限倍數(shù)是指把酶測(cè)定值轉(zhuǎn)換為正常上限值的倍數(shù)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，就是測(cè)定值除以正常上限值。不難發(fā)現(xiàn)，使用不同的方法、其單位、測(cè)定值和參考值均不一致，在解釋來(lái)自不同方法的結(jié)果時(shí)，幾乎很難看出其間確實(shí)有差異，但如果將各測(cè)定值分別轉(zhuǎn)

46、換成ULN值，則比較容易多了。,由于酶學(xué)測(cè)定中，一般以酶增加的異常較多，故不取正常下限值作為倍數(shù)指數(shù)。如將ULN進(jìn)一步適當(dāng)分級(jí)，制定出輕度、中度及極度增加的范圍，則更一目了然。有些酶測(cè)定要考慮到不同性別、年齡時(shí)間時(shí)，用ULN換算更能正確表達(dá)，就不致發(fā)生誤判。,七、系數(shù)K值的計(jì)算與應(yīng)用 在實(shí)際工作中，特別是用自動(dòng)生物化學(xué)分析儀測(cè)定同一酶，條件固定時(shí)，從理論上來(lái)講V、v和L均為固定值，ε為常數(shù)，則將上述公式可簡(jiǎn)化為：,,一般稱K為

47、酶活性濃度定量系數(shù)(或稱為常數(shù))，主要用于臨床酶活性測(cè)定的計(jì)算與校正。例如連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定血清中LD活性濃度，已知NADH的ε為6.22x103cm2·mol-1，血清量為50ul，底物液為1ml，比色杯光徑為lcm，則K=1.05x106／6.22x103x0.05xl=3376。,ε,(一)系數(shù)K值的意義與設(shè)置 系數(shù)K值對(duì)于酶的測(cè)定十分重要，過(guò)高雖然測(cè)定的線性較寬，但重復(fù)性差，反之，雖然精密度好，但檢測(cè)線性

48、窄。因此，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行合理的設(shè)置與應(yīng)用。K值的設(shè)置應(yīng)考慮測(cè)定酶的參考值上限及測(cè)定時(shí)間兩方面，以保證測(cè)定結(jié)果的可靠。這些都與儀器測(cè)定的噪音(noise)有關(guān)。,一般而言, 自動(dòng)分析儀吸光度噪音都需控制在0.001，也就是儀器保證對(duì)同一溶液反復(fù)測(cè)定時(shí)，吸光度誤差控制在0.001左右。如K值為8 000，每分鐘測(cè)定吸光度如有0.001微小變化，根據(jù)上式，結(jié)果將出現(xiàn)8U／L左右的誤差，這對(duì)于一些參考值較低的酶如轉(zhuǎn)氨酶來(lái)說(shuō)顯然太大。,此外，

49、如果測(cè)定時(shí)間由1min延長(zhǎng)到2min，此時(shí)0.001噪音對(duì)每分鐘測(cè)定吸光度誤差將減小一半，也就是說(shuō)，K值可以設(shè)置大一些。但如果測(cè)定時(shí)間只有0.5min，K值一般不超過(guò)4000。改變K值最簡(jiǎn)單的方法就是改變標(biāo)本的稀釋度，稀釋倍數(shù)越大，K值越大。,(二)系數(shù)K值的類型與計(jì)算 在連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定酶活性的試劑中，一般標(biāo)明指示物的理論ε。臨床實(shí)際工作中，儀器諸多因素如波長(zhǎng)的準(zhǔn)確性、半波寬的大小，比色池光徑及磨損與清潔度，溫控的準(zhǔn)確

50、性，加樣系統(tǒng)狀況等若不符合要求或發(fā)生變化都會(huì)影響指示物的ε值或上述公式中的有關(guān)項(xiàng)。因此，應(yīng)在具體儀器條件下，定期檢查和實(shí)際測(cè)定指示物的ε和系數(shù)K值(即儀器實(shí)測(cè)K值)。,340nm干涉濾光片的NAD(P)H的ε可用葡萄糖的己糖激酶法實(shí)測(cè)，即對(duì)已知濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行終點(diǎn)法測(cè)定，產(chǎn)生與葡萄糖相等摩爾數(shù)的NAD(P)H，計(jì)算其實(shí)測(cè)的ε，再計(jì)算實(shí)測(cè)K值。光柵式可直接使用文獻(xiàn)或試劑盒說(shuō)明書(shū)的數(shù)值。,NAD(P)H為指示酶的雙波長(zhǎng)(340nm／3

51、80nm)檢測(cè)法有兩種類型：　　①次波長(zhǎng)只用于減去血清的濁度與色素(只測(cè)一次)，連續(xù)監(jiān)測(cè)法只讀主波長(zhǎng)的吸光度，可直接用文獻(xiàn)數(shù)值；　?、谶B續(xù)監(jiān)測(cè)法全程用雙波長(zhǎng)讀吸光度，由于NAD(P)H在次波長(zhǎng)有吸光度，所以要用主波長(zhǎng)的ε減去次波長(zhǎng)的ε來(lái)計(jì)算系數(shù)K值。,八、臨床酶學(xué)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)化 　　測(cè)定酶活性濃度受諸多因素影響，如樣品的采集與貯存，所用儀器與試劑的復(fù)雜多樣，測(cè)定方法條件的差異等。為了提高酶學(xué)測(cè)定的準(zhǔn)確性和精密度，使酶測(cè)定結(jié)果

52、在方法間、實(shí)驗(yàn)室間有可比性，消除參考值的混亂，以利于臨床應(yīng)用，開(kāi)展酶學(xué)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)化工作勢(shì)在必行。,(一)標(biāo)準(zhǔn)化途徑 　　1.使用推薦方法和參考方法 推薦方法的使用，使各實(shí)驗(yàn)室間對(duì)同一種酶的測(cè)定結(jié)果具有可比性、可轉(zhuǎn)換性(commutability)。我國(guó)于1994年發(fā)表了《測(cè)定人血清(血漿)中酶催化濃度方法總則》，并于1995年、1996年相繼通過(guò)了ALT、γ-GT、CK、LD、ALP、AST等6項(xiàng)推薦方法草案。,2．使

53、用公認(rèn)的酶校正物或酶參考物 酶測(cè)定中最理想的校正方法是用穩(wěn)定的定值準(zhǔn)確的酶校正物或酶參考物對(duì)測(cè)定全過(guò)程進(jìn)行校正。 目前國(guó)內(nèi)外推薦有證參考物(certified reference material，CRM)、標(biāo)準(zhǔn)參考物(standard referencematerial，SRM)和酶參考物(ERM)用于酶學(xué)測(cè)定的校正。這些物質(zhì)的定值可溯源到各自的參考方法或推薦方法，能用于校正一個(gè)或多個(gè)常規(guī)方法。酶校正物的

54、使用可改進(jìn)方法間的符合程度，增加常規(guī)酶測(cè)定方法的可靠性。,(二) 全球參比體系 IFCC于1998年決定建立包括下列要素的測(cè)定酶催化濃度的全球參比體系： 1．參考測(cè)定方法 以原有的30℃的參考方法作為基礎(chǔ)，制定了一套37℃的標(biāo)準(zhǔn)操作方法(SOPs)。IFCC于2002年發(fā)表了關(guān)于酶催化濃度的原級(jí)參考方法總則及CK、LD、ALT、AST和γ-GT的SOPs。,2．參考實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)

55、 選擇一組參考實(shí)驗(yàn)室包括廠家實(shí)驗(yàn)室，為之提供必要的技術(shù)和儀器，使之在計(jì)量學(xué)高水平上按參考測(cè)定方法(SOPs)進(jìn)行測(cè)定。,3．參考物 參考實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)對(duì)現(xiàn)有的BCR參考物進(jìn)行重新認(rèn)證。 根據(jù)“對(duì)校正物和質(zhì)控物的酶催化濃度指定值的計(jì)量溯源”標(biāo)準(zhǔn)，酶的測(cè)量值由原級(jí)參考方法來(lái)確定，包括以下方面詳細(xì)的規(guī)定，即底物的種類及其濃度、緩沖液成分、pH、效應(yīng)物及其濃度、催化反應(yīng)的方向、指示物成分、溫度、孵育時(shí)間、延滯