紅花注射液生物活性測定方法的研究.pdf

1、目的：本課題以紅花注射液為研究對象，確定其生物活性測定的方法，優(yōu)化試驗條件，明確紅花注射液的主要活性成分及毒性物質，確定限值劑量及質量判定標準，并研究其主要活性成分的作用機理。
　　方法：(1)用四個不同廠家的紅花注射液，根據(jù)功能主治相關的5種藥效學試驗方法，篩選1~2種適宜的方法作為其生物活性測定方法。(2)對選定的試驗方法進行正交試驗優(yōu)化條件，確定紅花注射液在此條件下的限值劑量和質量標準，并對不同廠家多批次紅花注射液進行生物活

2、性測定，驗證其限值劑量和質量標準。(3)通過選用羥基紅花黃色素 A（HSYA）和總黃酮含量不同且合格的紅花注射液，采用選定的方法，測定紅花注射液的生物活性，確定其活性成分。(4)尾靜脈注射鉀離子（K+）、HSYA含量不同的紅花注射液0.5ml，觀察48小時內小鼠是否有死亡，判定引起毒性反應的物質。(5)采用腹腔注射垂體后葉（Pit）造成大鼠急性心肌缺血模型的方法，測定左心室肌組織中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）的變化以及觀察

3、 TTC染色心肌病理組織片，研究其作用機制。
　　結果：(1)小鼠體內血栓和家兔體外抗血小板聚集試驗基本符合紅花注射液生物活性測定方法要求。(2)小鼠體內血栓試驗優(yōu)化的試驗條件為：小鼠腹腔注射紅花注射液連續(xù)3天，以濃度為3.34g生藥/kg的紅花注射液作為其生物活性試驗的限值劑量，末次紅花注射液注射30min后尾靜脈注射血栓誘導劑（濃度配比為膠原蛋白0.6mg/ml-腎上腺素0.02mg/ml），當形成血栓后紅花注射液保護率≥50

4、％，且經(jīng)卡方檢驗與模型組有顯著性差異，以此作為判定產(chǎn)品合格的標準。家兔體外抗血小板聚集試驗優(yōu)化的試驗條件是：取家兔富血小板血漿（PRP）200μl，紅花注射液濃度為5.01g生藥/kg作為其生物活性試驗的限值劑量，加入50μl濃度為50μg/ml的ADP，當家兔血小板聚集抑制率≥25%，且經(jīng)T檢驗與陰性對照組有顯著性差異，以此指標作為產(chǎn)品合格的標準，當二者均符合規(guī)定者判定為合格，對12批次紅花注射液進行生物活性測定，83.3%通過此標準

5、。(3)當總黃酮含量基本一致時，隨著 HSYA含量降低，抗小鼠體內血栓形成的保護率和家兔體外血小板聚集抑制率也隨之降低；當 HSYA含量基本一致時，隨著總黃酮含量下降，保護率和抑制率也隨之降低；當紅花注射液中 HSYA和總黃酮的含量均低時，其保護率和抑制率也均低。(4)通過尾靜脈注射紅花注射液，觀察48小時內小鼠死亡數(shù)發(fā)現(xiàn)，當 K+<1600μg/ml時，各廠家紅花注射液 HSYA和K+變化時，小鼠均無死亡；當K+>1600μg/ml時

6、，HSYA在0.03mg/ml-0.82mg/ml范圍內的紅花注射液，小鼠均有死亡，工藝中加入除去 K+步驟后，小鼠均無死亡。(5)紅花黃色素可導致SOD活性增加，MDA含量降低，呈劑量關系，且與模型組有顯著性差異；經(jīng) TTC染色，紅花黃色素組梗死區(qū)面積少于模型組，且呈劑量關系。
　　結論：建立紅花注射液生物活性測定方法為小鼠體內血栓形成試驗和家兔體外抗血小板凝聚試驗。明確兩種生物活性測定方法的限值劑量：小鼠體內血栓形成試驗為3.