紅花注射液生物活性測(cè)定方法的研究.pdf

1、目的：本課題以紅花注射液為研究對(duì)象，確定其生物活性測(cè)定的方法，優(yōu)化試驗(yàn)條件，明確紅花注射液的主要活性成分及毒性物質(zhì)，確定限值劑量及質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn)，并研究其主要活性成分的作用機(jī)理。
　　方法：(1)用四個(gè)不同廠家的紅花注射液，根據(jù)功能主治相關(guān)的5種藥效學(xué)試驗(yàn)方法，篩選1~2種適宜的方法作為其生物活性測(cè)定方法。(2)對(duì)選定的試驗(yàn)方法進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化條件，確定紅花注射液在此條件下的限值劑量和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并對(duì)不同廠家多批次紅花注射液進(jìn)行生物活

2、性測(cè)定，驗(yàn)證其限值劑量和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。(3)通過選用羥基紅花黃色素 A（HSYA）和總黃酮含量不同且合格的紅花注射液，采用選定的方法，測(cè)定紅花注射液的生物活性，確定其活性成分。(4)尾靜脈注射鉀離子（K+）、HSYA含量不同的紅花注射液0.5ml，觀察48小時(shí)內(nèi)小鼠是否有死亡，判定引起毒性反應(yīng)的物質(zhì)。(5)采用腹腔注射垂體后葉（Pit）造成大鼠急性心肌缺血模型的方法，測(cè)定左心室肌組織中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）的變化以及觀察

3、 TTC染色心肌病理組織片，研究其作用機(jī)制。
　　結(jié)果：(1)小鼠體內(nèi)血栓和家兔體外抗血小板聚集試驗(yàn)基本符合紅花注射液生物活性測(cè)定方法要求。(2)小鼠體內(nèi)血栓試驗(yàn)優(yōu)化的試驗(yàn)條件為：小鼠腹腔注射紅花注射液連續(xù)3天，以濃度為3.34g生藥/kg的紅花注射液作為其生物活性試驗(yàn)的限值劑量，末次紅花注射液注射30min后尾靜脈注射血栓誘導(dǎo)劑（濃度配比為膠原蛋白0.6mg/ml-腎上腺素0.02mg/ml），當(dāng)形成血栓后紅花注射液保護(hù)率≥50

4、％，且經(jīng)卡方檢驗(yàn)與模型組有顯著性差異，以此作為判定產(chǎn)品合格的標(biāo)準(zhǔn)。家兔體外抗血小板聚集試驗(yàn)優(yōu)化的試驗(yàn)條件是：取家兔富血小板血漿（PRP）200μl，紅花注射液濃度為5.01g生藥/kg作為其生物活性試驗(yàn)的限值劑量，加入50μl濃度為50μg/ml的ADP，當(dāng)家兔血小板聚集抑制率≥25%，且經(jīng)T檢驗(yàn)與陰性對(duì)照組有顯著性差異，以此指標(biāo)作為產(chǎn)品合格的標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)二者均符合規(guī)定者判定為合格，對(duì)12批次紅花注射液進(jìn)行生物活性測(cè)定，83.3%通過此標(biāo)準(zhǔn)

5、。(3)當(dāng)總黃酮含量基本一致時(shí)，隨著 HSYA含量降低，抗小鼠體內(nèi)血栓形成的保護(hù)率和家兔體外血小板聚集抑制率也隨之降低；當(dāng) HSYA含量基本一致時(shí)，隨著總黃酮含量下降，保護(hù)率和抑制率也隨之降低；當(dāng)紅花注射液中 HSYA和總黃酮的含量均低時(shí)，其保護(hù)率和抑制率也均低。(4)通過尾靜脈注射紅花注射液，觀察48小時(shí)內(nèi)小鼠死亡數(shù)發(fā)現(xiàn)，當(dāng) K+<1600μg/ml時(shí)，各廠家紅花注射液 HSYA和K+變化時(shí)，小鼠均無死亡；當(dāng)K+>1600μg/ml時(shí)

6、，HSYA在0.03mg/ml-0.82mg/ml范圍內(nèi)的紅花注射液，小鼠均有死亡，工藝中加入除去 K+步驟后，小鼠均無死亡。(5)紅花黃色素可導(dǎo)致SOD活性增加，MDA含量降低，呈劑量關(guān)系，且與模型組有顯著性差異；經(jīng) TTC染色，紅花黃色素組梗死區(qū)面積少于模型組，且呈劑量關(guān)系。
　　結(jié)論：建立紅花注射液生物活性測(cè)定方法為小鼠體內(nèi)血栓形成試驗(yàn)和家兔體外抗血小板凝聚試驗(yàn)。明確兩種生物活性測(cè)定方法的限值劑量：小鼠體內(nèi)血栓形成試驗(yàn)為3.