血清谷丙轉氨酶活性的測定

1、血清谷丙轉氨酶活性的測定（King法）,【目的要求】1.掌握血清谷丙轉氨酶活性測定的基本原理。2.熟悉血清谷丙轉氨酶活性測定的具體操作方法。3.了解血清谷丙轉氨酶活性測定的臨床意義。,【原理】生物機體內轉氨基作用是α-氨基酸的氨基通過酶促作用轉移到α－酮酸的酮基位置上，生產相應的酮酸和氨基酸的化學反應。催化這反應的酶稱為轉氨酶（transaminase），其輔酶為磷酸吡哆醛。轉氨酶廣泛存在于機體的各種組織中，在肝、心、腎等組織中

2、的谷丙轉氨酶（glutamic pyruvic transaminase , GPT），谷草轉氨酶（glutamic oxalacetic transaminase , GOT）活性較高。在正常的新陳代謝過程中，血清內維持一定水平的轉氨酶活性（即正常值）。當肝、心、腎等組織發(fā)生病變時，由于組織細胞腫脹，壞死導致大量的酶釋放至血流中，從而引起血清谷丙轉氨酶（GPT）、谷草轉氨酶（GOT）活性顯著升高。因此測定這些酶的活性對某些疾病的臨場診

3、斷具有重要的參考價值。,血清中的谷-丙轉氨酶（ALT），在37℃、pH7.4的條件下，可催化基質（底物）液中的丙氨酸與α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸：,生成的丙酮酸可與起終止和顯色作用的2,4二硝基苯肼發(fā)生加成反應，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，進而在堿性環(huán)境中生成紅棕色的苯腙硝醌化合物，其顏色的深淺在一定范圍內與丙酮酸的生成量，亦即與ALT活性的高低成正比關系。據此與同樣處理的丙酮酸標準液相比較，便可算出或通過標準曲線查出血清中AL

4、T的活性。,,,King 氏法谷丙轉氨酶活性單位：每毫升血清在 37℃與 pH7.4 的基質液作用 60min，生成 1μmol 丙酮酸為一個單位。臨床檢驗取血清量為 0.1mL，報告數據以 100mL 血清計算，因此實際測得結果乘 1000 即可。例如 0.1mL 丙酮酸標準液中丙酮酸含量為 0.2μmol，即相當 GPT200U/100mL。,試劑與器材,1、樣品 動物或人血清2試劑 1) 甲液（1/15 m

5、ol/L 磷酸氫二鈉溶液） 稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4，A. R.）9.47g 或含十二水磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O，A. R.）23.87g溶于蒸餾水中定容至 1000mL。 2) 乙液（1/15 mol/L 磷酸二氫鉀溶液） 稱取磷酸二氫鉀（KH2PO4，A. R.）9.078g溶于蒸餾水中定容至 1000mL。 取甲液 825mL，乙液 175mL 混合，此

6、液 PH應為 7.4。 3) GPT 基質液 稱取α－酮戊二酸 29.2mg（2mmol/L）及α－DL－丙氨酸 1.78g（200 mmol/L）溶于 50mL pH7.4 的磷酸緩沖液中，加 0.1 mol/L NaOH溶液約 0.5mL，調節(jié) pH為 7.4，然后加磷酸緩沖液定容至 100mL。加少許氯仿防腐，置冰箱中保存。,4) 2，4－二硝基苯肼（1mmol/L） 稱 2，4－二硝基苯肼 20

7、mg。先溶于 10mL 濃鹽酸中，使其溶解。再以蒸餾水定容至100mL。 5) 丙酮酸標準液 精確稱取丙酮酸鈉 22mg。加磷酸緩沖液溶解后定容至 100mL。此溶液濃度為 2μmol/mL，臨用前配制。 0.4mol/L NaOH 溶液，1/15 mol/L 磷酸緩沖液（pH7.4）。 3、器材 試管及試管架，移液管（0.5mL，1 mL，5 mL），量筒（10 mL，100 mL），恒溫水浴，72

8、2 型分光光度計，坐標紙。,實驗內容和步驟,1) 制備標準曲線,2) 繪制標準曲線,以光吸收值為縱坐標，酶活性單位數為橫坐標，在坐標紙上繪制各測得A520值與對應的酶活性單位數的標準曲線。,3) 樣品測定,,,結果計算,標準曲線測定法 根據樣品管 A520 值（已減去空白管 A520）查標準曲線，即得每 100mL 血清中轉氨酶活性單位數。 標準管測定法 每次測定酶活性時，同時用丙酮酸標準液（2μmol/mL）0.1mL，平

9、行操作，即按上表操作，不做標準曲線，測定A520按下公式計算：,比色測定法，如：金氏法（King法）、穆氏法（Mohun 法）和賴氏法（Reitman-Frankel法）。其原理、試劑、操作步驟及作用溫度等完全相同。不同之處在于作用時間：King法60min ，Mohun法和 Reiman法30min。因此它們的單位定義和標準曲線制備也不同。King法單位定義是：每1ml血清在37℃條件下與底物作用60 min，生成1μmol丙酮酸稱為

10、一個單位。 Mohun 法單位定義是：每毫升血清在pH=7.4，37℃條件下與底物作用30 min，每生成2.5微克丙酮酸為1單位。賴氏法沒有制定自身的單位定義，而是以實驗數據套用速率法的卡門氏單位作表示的。1個卡門氏單位的定義是：在溫度25℃，pH7.4，波長340nm，光徑1cm的條件下，1ml血清使NADH的吸光度下降0.001的轉氨酶活性。可見卡門氏單位不是用物質的量濃度，而是用物質的吸光度表示酶的活性單位的。若將卡門氏單位的定

11、義條件代入國際單位計算公式，即得卡門氏單位與國際單位的換算關系：1卡門氏單位=0.4821 IU/L(25℃)，便可將卡門氏單位兌換成國際單位。,改原賴氏法的反應溫度(40℃改為37℃)和底物濃度(改為低濃度)的改良賴氏法，對卡門氏單位的科學套用，使比色法一些缺陷得到了卓有成效的克服，使其結果與速率法較為一致，能較好反映酶的真實活性。由于賴氏法設計的底物濃度,如a-酮戊二酸不足，反應速度只能達到最大速度的65%；顯色劑2,4-二硝基苯

12、肼的用量只及反應液中酮酸濃度的一半；保溫30min的酶促反應后，新生成的丙酮酸和未用完的a-酮戊二酸存在著無法人為控制的競爭顯色的幾率問題，如此等等，使賴氏法的重現性較差，在測量精度上仍與連續(xù)監(jiān)測法相差甚大。,注意事項,1) 為防止溶血及其他因素對酶活性測定的影響，實驗過程所用的一切器皿（注射器、試管等）應清洗干凈，干燥后方能使用。 2) 空腹取血，避免血脂干擾。迅速分出血清，及時測定。 3) 作為標準物質的丙酮酸鈉極易變質。

13、配試劑時應選擇外觀潔白干燥者。若顏色變黃或潮解，則應重結晶，干燥至衡重后再用。 丙酮酸鈉重結晶：取純丙酮 8 份與蒸餾水 2 份混合，加入變質的丙酮酸鈉使其達到飽和。此時溶液上層無色，下層有棕黃色油狀物。取出上層無色液體置燒杯中，加入兩倍體積的丙酮（無水）混勻后，置冰箱中數小時，則有白色丙酮酸鈉析出，用布氏漏斗收集沉淀，并用純丙酮洗滌兩次，抽干后，置干燥器內，保存、備用。 4) 轉氨酶只能作用于α－L－氨基酸（L－天冬氨酸，L－丙

14、氨酸），對 D－氨基酸無催化作用。實驗室多用α－DL 氨基酸（因較 L－氨基酸價廉），如采用α―L―氨基酸,則需按α－DL 氨基酸的用量減半。 5) 為保證操作結果可靠，測定酶活性時應恒定 PH，保溫時間，選用固定的比色計，比色杯以減少誤差。 6) 血清轉氨酶活性高于 500（U）/100mL 血清時，應將血清稀釋一定倍數重新測定，其結果應乘以稀釋倍數。 7) 每次測定樣品數不要太多，其數量以在顯色后 30min 內完成比色