丙谷二肽的酶促合成研究.pdf

1、本文以重要的腸外營養(yǎng)用藥——丙谷二肽的酶法制備為核心內(nèi)容,設(shè)計完成了包括引入保護基、催化肽鍵合成、脫保護基三步構(gòu)成的完整合成工藝路線,并對主要酶促合成工藝條件進行了分析優(yōu)化；在此基礎(chǔ)上,引入CLEA技術(shù),對合成中涉及的兩種重要酶制劑——木瓜蛋白酶和青霉素G?；高M行新型固定化酶技術(shù)開發(fā),優(yōu)化制備條件,考察催化性質(zhì),表征形貌結(jié)構(gòu)；同時,開展CLEA微囊化方法的探索研究,為丙谷二肽的高收率、低成本制備提供有益參考,主要研究結(jié)果如下:

2、　　 酶促合成丙谷二肽:以木瓜蛋白酶和青霉素G?；笧橹饕磻?yīng)用酶,成功制得丙谷二肽；全套反應(yīng)由引入保護基、木瓜蛋白酶酶促肽鍵合成和青霉素G酰化酶催化脫保護三步構(gòu)成,各步反應(yīng)收率最終為86.41％,30.5％和94.8％,總收率為24.98％。；合成過程中,采用HPLC-MS、核磁等手段對產(chǎn)物進行檢測鑒定；同時,開發(fā)了以制備色譜為主的目標(biāo)物分離提純方法。
　　 木瓜蛋白酶催化phac-Ala-Gln的合成:反應(yīng)由動力學(xué)控制,通

3、過優(yōu)化工藝條件,得出在pH8.8,25℃,助溶劑乙醇添加量為1.5mL,游離酶濃度0.02g/mL,Gln濃度0.5mol／L,Phac-Ala-OMe濃度0.05mol／L,添加KCl濃度為0.1mol／L,反應(yīng)160min情況下,合成苯乙酰基保護的丙谷二肽收率最高,可達30.5％；將木瓜蛋白酶CLEA應(yīng)用于反應(yīng),15h時收率為9.32％:針對CLEA技術(shù)應(yīng)用中存在的顆粒較小,不利于工業(yè)化應(yīng)用的問題,提出囊化解決方案,制得6種木瓜蛋白

4、酶CLEA微囊,對結(jié)構(gòu)性質(zhì)進行表征,其中實心海藻酸鈣微囊酶活保留最高,達53.42％。
　　 青霉素G?；复呋摫Ｗo基生成Ala-Gln:將青霉素G酰化酶游離酶應(yīng)用于Ala-Gln的合成,反應(yīng)0.33h,收達94.8％；制備得到青霉素G酰化酶CLEA,優(yōu)化條件為:飽和硫酸銨溶液為沉淀劑,與酶液體積比為2.3:1時為最適用量,戊二醛為交聯(lián)劑,濃度0.35％,交聯(lián)時間為2h,溫度4℃,最終酶活保留可達52.61％；所得CLEA的最