性激素抑制劑與異基因造血干細(xì)胞移植后胸腺功能的關(guān)系研究.pdf

1、研究背景和目的： 異基因造血干細(xì)胞移植(allo—HSCT)是目前治療各種造血系統(tǒng)和非造血系統(tǒng)腫瘤、再生障礙性貧血、自身免疫性疾病和某些遺傳性疾病的主要和有效手段。移植物抗宿主病(GVHD)和移植后免疫重建延遲導(dǎo)致的感染、腫瘤復(fù)發(fā)以及第二腫瘤發(fā)生是allo—HSCT后的主要并發(fā)癥和致死原因。因此，降低移植后GVHD發(fā)生率、減輕GVHD嚴(yán)重程度和加速移植后免疫系統(tǒng)重建是提高患者移植后長(zhǎng)期生存率和生存質(zhì)量的重要方法和手段。

2、目前，減輕移植后胸腺上皮細(xì)胞(TECs)損傷和胸腺輸出功能破壞的相關(guān)因素有性激素抑制劑、角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子、生長(zhǎng)激素、白介素—7(IL—7)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等。性激素導(dǎo)致胸腺損傷的機(jī)理目前仍不清楚，可能與胸腺基質(zhì)上的性激素受體有關(guān)，利用性腺摘除或藥物去勢(shì)方法降低性激素水平能逆轉(zhuǎn)胸腺損傷，在恢復(fù)移植后胸腺對(duì)T細(xì)胞的修飾功能和輸出功能的同時(shí)不會(huì)加重GVHD和減輕移植物抗白血病(GVL)效應(yīng)。Marchetti和Heng等報(bào)道能抑制性激素的促性

3、腺激素釋放激素(LHRH)作為藥物去勢(shì)，能促進(jìn)移植后胸腺功能的恢復(fù)，從而促進(jìn)免疫重建。 本文通過(guò)構(gòu)建C57BL/6→BALB/c小鼠HLA不相合allo—HSCT模型和性激素抑制劑處理的小鼠allo—HSCT模型；對(duì)小鼠胸腺行胸腺細(xì)胞內(nèi)INFγ、TNFα和IL-1β細(xì)胞因子水平檢測(cè)；利用實(shí)時(shí)定量PCR(FAM熒光探針?lè)?分析小鼠外周血T細(xì)胞的siTRECs水平，探討aGVHD對(duì)胸腺功能的影響，并評(píng)價(jià)LHRH對(duì)allo—HSCT后

4、胸腺功能的保護(hù)作用。 研究方法： 1、構(gòu)建C57BL/6→BALB/c小鼠allo—HSCT模型 2、構(gòu)建雌激素抑制劑LHRH處理的去勢(shì)BALB/c小鼠allo—HSCT模型 3、構(gòu)建BALB/c→BALB/c小鼠auto—HSCT模型 4、實(shí)驗(yàn)分組；實(shí)驗(yàn)分5組，分別為allo—HSCT小鼠組(A組)，LHRH處理的allo—HSCT小鼠組(B組)，auto—HSCT小鼠組(C組)，正常BALB/

5、c雌性小鼠組(D組)和正常C57BL/6雄性小鼠組(E組)，D組和E組為正常對(duì)照組。 5、造血重建標(biāo)準(zhǔn)：外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)>1.0×109/L為造血重建指標(biāo)，并通過(guò)嵌合體檢測(cè)證實(shí)骨髓植入成功。 6、嵌合體檢測(cè)：PCR擴(kuò)增外周血基因組Y染色體基因。 7、aGVHD表現(xiàn)與評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：aGVHD判斷通過(guò)觀察：體重變化、食欲、精神狀態(tài)，活動(dòng)能力，皮膚黏膜，腹瀉等情況，在移植后+14d，根據(jù)體重減輕、姿態(tài)、活動(dòng)能力、

6、毛發(fā)和皮膚對(duì)每只小鼠進(jìn)行aGVHD評(píng)分，并結(jié)合皮膚、肝臟aGVHD病理表現(xiàn)評(píng)價(jià)aGVHD嚴(yán)重程度。 8、胸腺細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子INFγ、TNFα和IL-1β的檢測(cè)：采用蛋白液相測(cè)定方法進(jìn)行檢測(cè)。 9、胸腺功能測(cè)定：采用熒光定量PCR(FAM熒光探針?lè)?測(cè)定外周血sjTRECs水平。 10、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理。結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(—X±SD)表示，兩組間比較采用indepen

7、dentT—test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間比較采用One—wayANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用LSD多重比較法。隨時(shí)間變化的變量比較采用重復(fù)測(cè)量統(tǒng)計(jì)分析。一個(gè)因變量與多個(gè)自變量間的線性數(shù)量關(guān)系用linearregression進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 討論： Allo—HSCT后T細(xì)胞免疫重建延遲引起的感染、腫瘤復(fù)發(fā)和第二腫瘤是影響移植療效的重要原因之一，而胸腺作為主要的免疫器官，其結(jié)構(gòu)損傷和功

8、能低下是引起T細(xì)胞免疫重建延遲的最主要因素。因此，探討allo—HSCT后胸腺損傷的機(jī)理、預(yù)防和減輕胸腺損傷的方法以及促進(jìn)胸腺功能恢復(fù)的途徑對(duì)重建allo—HSCT后完善的免疫功能具有十分重要的意義。 在allo—HSCT中，放療、化療和aGVHD等因素均可以損傷宿主胸腺微環(huán)境，破壞胸腺對(duì)移植后T細(xì)胞的修飾和輸出功能，影響T細(xì)胞重建，從而增加allo—HSCT后宿主感染發(fā)生、腫瘤復(fù)發(fā)以及第二腫瘤發(fā)生率。有報(bào)道指出，GVHD是導(dǎo)致

9、allo—HSCT后胸腺損傷的主要原因。在GVHD患者中，供者T細(xì)胞通過(guò)釋放各種細(xì)胞因子如INFγ和TNFα等對(duì)胸腺組織進(jìn)行損傷，并誘導(dǎo)胸腺細(xì)胞凋亡，從而破壞移植后胸腺功能。因此，如何減輕移植后胸腺損傷和功能破壞對(duì)于促進(jìn)移植后免疫重建有重要意義。在手術(shù)切除性腺的小鼠移植模型中觀察到性腺摘除能逆轉(zhuǎn)GVHD對(duì)胸腺損傷，恢復(fù)移植后胸腺對(duì)T細(xì)胞的修飾功能和輸出功能。Marchetti和Heng等最近報(bào)道LHRH作為藥物去勢(shì)，也能促進(jìn)移植后胸腺功

10、能的恢復(fù)，從而促進(jìn)免疫重建。本研究構(gòu)建C57BL/6→BALB/c小鼠HLA不相合allo—HSCT模型、LHRH處理的aGVHD小鼠模型及非GVHD小鼠模型。比較發(fā)生aGVHD的小鼠和非GVHD小鼠細(xì)胞因子得出：aGVHD的小鼠胸腺細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子INFγ、TNFα和IL-1β水平明顯高于非GVHD小鼠。且aGVHD評(píng)分越高，INFγ水平也越高。這些提示INFγ、TNFα和IL-1β可能參與了aGVHD對(duì)胸腺的損傷過(guò)程。另外，我們?cè)谝浦?/p>

11、前采用LHRH藥物去勢(shì)的方法對(duì)小鼠胸腺進(jìn)行保護(hù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)非LHRH處理的aGVHD小鼠GVHD評(píng)分明顯高于LHRH處理的小鼠，且非LHRH處理的aGVHD小鼠的胸腺細(xì)胞內(nèi)INFγ、TNFα和IL-1β細(xì)胞因子水平明顯高于LHRH處理小鼠。這些結(jié)果表明，藥物去勢(shì)能減輕胸腺損傷的同時(shí)通過(guò)保護(hù)胸腺而減輕移植后aGVHD的嚴(yán)重程度。但性激素抑制劑減輕GVHD損傷胸腺的機(jī)理仍有待進(jìn)一步探討。 結(jié)論： 1、成功構(gòu)建了C57BL/6→

12、BALB/c小鼠allo—HSCT模型、性激素抑制劑LHRH處理的去勢(shì)BALB/c小鼠allo—HSCT模型和BALB/c→BALB/c小鼠auto—HSCT模型。 2、aGVHD是移植后胸腺損傷的原因之一，細(xì)胞因子INFγ、TNFα和IL-1β可能參與了aGVHD對(duì)胸腺的損傷過(guò)程。 3、LHRH藥物去勢(shì)能降低胸腺細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子INFγ、TNFα和IL-1β水平，減輕GVHD對(duì)胸腺的損傷。 4、LHRH藥物去勢(shì)通