粘細(xì)菌的環(huán)境分布、季節(jié)演替及其相互作用.pdf

1、粘細(xì)菌(myxobacteria)是一類能夠滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)的革蘭氏陰性桿菌，在系統(tǒng)進(jìn)化上對(duì)應(yīng)變形菌門、δ變形菌綱的粘球菌目（Myxococcales），分為3個(gè)亞目，23個(gè)屬和50多個(gè)種。粘細(xì)菌能夠產(chǎn)生豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物，被公認(rèn)為是繼放線菌之后的又一個(gè)重要的藥源微生物新類群;因其具有復(fù)雜的多細(xì)胞群體行為和能形成多細(xì)胞聚集、形態(tài)特異的子實(shí)體結(jié)構(gòu)，被認(rèn)為是“社會(huì)性的細(xì)菌”。
　　粘細(xì)菌曾被認(rèn)為是一類典型的土壤微生物，近年來淺海水域分離得到嗜

2、鹽和耐鹽菌株;分子生態(tài)學(xué)研究表明在海洋不同深度、不同位置的沉積物中均有粘細(xì)菌分布。此外，一些文獻(xiàn)報(bào)道了湖泊河流中粘細(xì)菌的分離純化，但這些菌株在形態(tài)上與陸地粘細(xì)菌高度相似，長(zhǎng)期以來人們普遍認(rèn)為水流或風(fēng)力把陸地粘細(xì)菌的子實(shí)體帶入淡水環(huán)境，淡水生境只是粘細(xì)菌的“暫居地”。因此，淡水環(huán)境是否為粘細(xì)菌的重要生境依然不清晰。
　　我們?cè)诔毯：杉练e物樣品，進(jìn)行菌株分離純化，共獲得113株粘細(xì)菌，絕大多數(shù)菌株隸屬于Myxococcus、Sor

3、angium和Nannocystis，與分離自土壤的典型菌株形態(tài)高度相似，且16SrRNA基因的差距在2％以內(nèi);其中三株菌位于進(jìn)化樹的獨(dú)立分支，與Cystobactergracilis的相似性在92.2％與97.5％之間，可能屬于新的種屬。使用試劑盒提取1.0g沉積物的總DNA，并分兩步對(duì)沉積物中的細(xì)菌群落進(jìn)行454高通量測(cè)序。首先，使用兩對(duì)通用細(xì)菌引物分別擴(kuò)增16SrRNA基因的V3-V4高變區(qū)和V6-V8高變區(qū)，構(gòu)建通用細(xì)菌文庫UV

4、34和UV678，分別獲得25305和30604條高質(zhì)量序列，包括2546和5559個(gè)種(以0.03的差異水平劃分OTU)。粘細(xì)菌是沉積物細(xì)菌群落中的主要種群，占據(jù)序列數(shù)量的5.77％（在目的水平據(jù)第三位;兩個(gè)文庫中分別為7.25％和4.29％）和種類的7.52％（據(jù)第一位;兩個(gè)文庫中分別為9.62％和5.41％）;粘細(xì)菌中較多的幾個(gè)屬是Archangium(16.63％)、Anaeromyxobacter(9.14％)、Kofleri

5、a(8.77％)、Chondromyces(4.45％)和Phaselicystis(4.15％)，其他屬均低于3％。然后，分別使用Cystobacterineae和Sorangineae特異引物構(gòu)建粘細(xì)菌的特異文庫CV34和SV678，Cystobacterineae中較多的幾個(gè)屬是Anaeromyxobacter、Cystobacter和Corallococcus;Sorangineae中較多的屬是Byssovorax、Sorang

6、ium和Phaselicystis。
　　隨后，我們調(diào)查了公開發(fā)表的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，在三個(gè)研究共39組普通淡水沉積物樣品中(290658條細(xì)菌序列)，粘細(xì)菌普遍存在，平均數(shù)量比例為(3.73±2.84)％，但不同樣品中粘細(xì)菌的內(nèi)部分類單元組成差距較大;在普通淡水水體和溫泉環(huán)境中，粘細(xì)菌的比例則很低(＜0.3％)。這些結(jié)果表明普通淡水沉積物是粘細(xì)菌的重要生境。土壤、海洋和淡水粘細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育比較分析顯示，陸地、海洋粘細(xì)菌在高分類水平

7、（科）分離，即使在同一個(gè)分支，海洋粘細(xì)菌和陸地粘細(xì)菌的序列差異一般也比較大;淡水環(huán)境粘細(xì)菌一般和陸地粘細(xì)菌處于相同分支，與陸地序列親緣關(guān)系近于海洋序列，但仍有部分序列形成了獨(dú)立于陸地、海洋粘細(xì)菌的特有分支（特有的分類單元）。
　　另一方面，粘細(xì)菌在土壤生境中分布廣泛，但因其捕食特征和多細(xì)胞群體行為，而被認(rèn)為是一類數(shù)量偏少的種群。一個(gè)常規(guī)土壤樣品(SDU)的宏基因組測(cè)序顯示，粘細(xì)菌在數(shù)量和種類上分別占4.10％和7.75％，是優(yōu)勢(shì)菌

8、群。為深入理解粘細(xì)菌多樣性的橫向范疇（環(huán)境分布）和縱向范疇（季節(jié)演替），我們?cè)敿?xì)考察了公共數(shù)據(jù)庫各類生境中粘細(xì)菌的存在及數(shù)量比例。在森林、草地、農(nóng)田等普通土壤中（525組數(shù)據(jù)，6776656條細(xì)菌序列），粘細(xì)菌在細(xì)菌群落中的比例約為（3.01±2.35）％;在海灘泥沙、極地的苔原冰川沙漠等非典型的土壤環(huán)境，粘細(xì)菌的平均數(shù)量比例也在1％以上;在普通淡水環(huán)境沉積物中，粘細(xì)菌分布廣泛且數(shù)量較多(3.73％);普通淡水水體中粘細(xì)菌分布較為普遍，

9、存在于85.8％的樣品，但數(shù)量比例較低，僅為0.23％;在溫泉及海洋環(huán)境中，粘細(xì)菌數(shù)量一般小于0.2％，且存在不具有普遍性(26.7％-68.5％)。
　　分析全球各地320組有采樣時(shí)間記錄的土壤樣品，其中粘細(xì)菌的平均比例為3.41％（粘細(xì)菌數(shù)目與細(xì)菌數(shù)目的Pearson相關(guān)性分析，R2=0.6827，F(xiàn)檢驗(yàn)P＜0.001）。在不考慮樣品之間差異的情況下，粘細(xì)菌的比例似乎有隨季節(jié)周期性變化的趨勢(shì)，在春季（3-5月）和秋季（9-11

10、月）較多，而夏季和冬季則減少。選擇一組對(duì)樣品進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)（5，6，7，8，10，11六個(gè)月）的測(cè)序數(shù)據(jù)（凱洛格生物站測(cè)序樣品），其中粘細(xì)菌的平均比例為（2.27±0.69）％，在目的水平據(jù)第8位。三種土壤類型中粘細(xì)菌都有8月份數(shù)量、種類減少的趨勢(shì);這與整個(gè)細(xì)菌群落多樣性（以Faith'sphylogeneticdiversity作為指標(biāo)）以及其他捕食性細(xì)菌的變化趨勢(shì)均不相同。粘細(xì)菌的波動(dòng)幅度最小，且數(shù)量維持在穩(wěn)定的較高水平(1.2％-3

11、.2％)。三種土壤類型的細(xì)菌群落多樣性幾乎都與土壤濕度和溫度顯著相關(guān)，而環(huán)境參數(shù)對(duì)各類捕食性細(xì)菌的數(shù)量比例影響均不明顯;推測(cè)環(huán)境因素對(duì)微生物群落的影響并非具體到每一個(gè)類群，粘細(xì)菌的數(shù)量變化是多種環(huán)境參數(shù)、甚至生物因素綜合作用的結(jié)果，而每種參數(shù)對(duì)其影響都不是線性的，需要結(jié)合實(shí)際情況進(jìn)行分析:8月份樣品采集前持續(xù)的高溫干燥導(dǎo)致了粘細(xì)菌進(jìn)入休眠狀態(tài)，即形成子實(shí)體，期間大量的細(xì)胞(60-90％)發(fā)生程序性死亡致使粘細(xì)菌數(shù)量顯著下降;之后經(jīng)過幾次

12、降水，土壤濕度回升，10月份（秋季）樣品中粘細(xì)菌數(shù)量比例上調(diào);到了11月份，低溫（促使粘細(xì)菌以形成子實(shí)體的形式休眠）逐漸成為限制因素，其數(shù)量增長(zhǎng)變慢甚至略有下降。土壤類型對(duì)粘細(xì)菌的影響可能表現(xiàn)在最大值出現(xiàn)時(shí)間、數(shù)值波動(dòng)幅度等方面。統(tǒng)計(jì)各樣品的粘細(xì)菌內(nèi)部組成并進(jìn)行聚類分析，樣品沒有因土壤類型或采集時(shí)間聚集，說明粘細(xì)菌的內(nèi)部組成也是多種因素（土壤類型、采集時(shí)間、各種環(huán)境參數(shù)、生物因素等）綜合作用的結(jié)果。粘細(xì)菌各科隨季節(jié)的變化趨勢(shì)各不相同，甚

13、至有此消彼長(zhǎng)的趨勢(shì)，暗示了粘細(xì)菌群落中各分類單元具有差異性，存在著種間相互作用。
　　產(chǎn)自纖維堆囊菌的大環(huán)內(nèi)酯類化合物埃博霉素(Epothilones)，是一種作用機(jī)理類似紫杉醇的抗腫瘤藥物，目前已有結(jié)構(gòu)類似物商品化上市。相對(duì)于埃博霉素需求的日趨增長(zhǎng)，通過纖維堆囊菌發(fā)酵產(chǎn)生的埃博霉素產(chǎn)量極低成為其價(jià)格高昂的主要原因。埃博霉素產(chǎn)生菌只占分離菌株數(shù)目的2.5％，是相對(duì)稀缺的資源菌株;纖維堆囊菌生長(zhǎng)緩慢，遺傳操作困難，而異源表達(dá)埃博霉素

14、的產(chǎn)量經(jīng)過發(fā)酵優(yōu)化后仍然很低。因此，我們采取了菌株改良與發(fā)酵優(yōu)化外的兩種策略:尋找更多的埃博霉素產(chǎn)生菌，以期分離到具有優(yōu)良性狀的菌株，用于后續(xù)的基因操作，還可以對(duì)比研究埃博霉素的合成機(jī)制;利用纖維堆囊菌的共培養(yǎng)，驗(yàn)證種內(nèi)相互作用是否像種間相互作用一樣影響（提高）次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。
　　結(jié)合前期工作中獲得的菌株，我們發(fā)現(xiàn)相對(duì)于未知土壤的低埃博霉素陽性菌株比例(2.5％)，在陽性土壤中進(jìn)行菌株二次分離，可以獲得較多的埃博霉素產(chǎn)生菌(

15、25％-75％);在一個(gè)陽性土壤附近10平方千米內(nèi)的幾個(gè)土樣中，陽性菌株的比例也較高(27.3％)。分析一個(gè)陽性菌株(So0157-2)的基因組發(fā)現(xiàn)，埃博霉素基因簇連同上下游共計(jì)128kb的區(qū)段可能來自水平基因轉(zhuǎn)移。對(duì)比三株菌的埃博霉素全基因簇，其相似性約為98.5％;埃博霉素基因簇中的酰基轉(zhuǎn)移酶(AT)結(jié)構(gòu)域顯著區(qū)別于其他來源（非纖維堆囊菌或纖維堆囊菌中其他基因）的AT;在4個(gè)已報(bào)道埃博霉素基因簇的纖維堆囊菌中，同一模塊中的AT蛋白序

16、列差異水平都小于3.2％;14株纖維堆堆囊菌的ATModC2（epoC模塊的第2個(gè)AT結(jié)構(gòu)域）的蛋白序列的最大差異約為5.8％。這說明了埃博霉素基因簇的高度保守與相對(duì)多樣。單個(gè)樣品中獲得的16SrRNA基因序列最大差異約為3.1％，與不同土壤來源的菌株序列差異相當(dāng)，而埃博霉素產(chǎn)量更是相差2000倍以上，這說明了單一樣品中纖維堆囊菌的多樣化。對(duì)于遺傳操作復(fù)雜的微生物，尋找更多的陽性菌株是一種可供選擇的簡(jiǎn)明有效策略。
　　在兩個(gè)不同土

17、樣各選擇6株纖維堆囊菌（產(chǎn)生埃博霉素或不產(chǎn)生埃博霉素）進(jìn)行共培養(yǎng)的影響研究。菌株之間在生長(zhǎng)上均呈現(xiàn)明顯的相互抑制，雙方生長(zhǎng)變?nèi)?，生物量低于純培養(yǎng)物對(duì)照（兩個(gè)純培養(yǎng)物生物量之和）的35％，推測(cè)由空間和營養(yǎng)的爭(zhēng)奪所致。共培養(yǎng)大大影響了埃博霉素產(chǎn)量，45個(gè)組合平均提高倍數(shù)為2.45±3.25;33個(gè)組合的產(chǎn)量顯著改變（提高或降低倍數(shù)在50％以上）;29個(gè)(64.4％)組合產(chǎn)量提高，最大提高倍數(shù)為10.4。熒光定量PCR顯示，共培養(yǎng)物中埃博霉素

18、的8個(gè)基因區(qū)段表達(dá)量均上調(diào)，提升倍數(shù)為2.41-7.16?？赡苁且?yàn)榛虼厣洗嬖诓恢挂粋€(gè)啟動(dòng)子，或者mRNA的不同區(qū)段降解速率不同，導(dǎo)致了各區(qū)段檢測(cè)到的表達(dá)量提升有所不同。當(dāng)然，影響埃博霉素基因簇轉(zhuǎn)錄水平改變的深層機(jī)制還有待闡明。
　　本工作確認(rèn)了粘細(xì)菌在淡水沉積物中的普遍存在，表明淡水沉積物是粘細(xì)菌的重要生境;詳細(xì)探討了粘細(xì)菌在各類環(huán)境中的分布及多樣性，發(fā)現(xiàn)土壤粘細(xì)菌數(shù)量比例有隨季節(jié)動(dòng)態(tài)變化的趨勢(shì);粘細(xì)菌內(nèi)部各分類單元的季節(jié)性變