lactobacillus菌株的益生功能評價(jià)

1、現(xiàn)代食 品科技 Mo d e r nF o o dS c i e n c ea n dT e c h n o l o g y2 0 1 2 ， V o 1 ． 2 8 ， No ． 8L a c t o b a ci ／ ／ u s 菌株 的益生功 能評價(jià) 妥彥峰 ，張偉欽 ，張?zhí)m威 。 ，艾連中( 1 ． 光明乳業(yè)股份有限公 司，乳業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 2 0 0 4 3 6 ) ( 2 ． 塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，

2、新疆 阿拉爾 8 4 3 3 0 0 ) ( 3 ． 哈 爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈 爾濱 15 0 0 9 0 )摘要： 本研究評價(jià) 了分 離自 傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中 4 株 L ． p a r a c a s e is u p s p ． p a r a c a s e i 菌株在模擬 胃、 腸液中的存活性， 在 H T - 2 9 細(xì)胞 上 的粘附性， 對致病菌的抑制能力， 以及刺激外周血單核 細(xì)胞 ( P B MC s

3、 ) 增殖的能力。 其中菌株 L a c t o b a c i l l u s p a r a c a s e is u p s p ． p a r a c a s e iM5 A L 、 J 2 3 A L在模擬 胃液存活率較高，而菌株 L a c t o b a c i l l u s p a r a c a s e is u p s p ． p a r a c a s e i G 1 5 A L 、 T 3 A L 在 胃液中

4、暴露 3h 即失去活性；4 株 菌在模擬腸液中存活率較 高。 菌 株 L ． p a r a c a s e is u p s p ． p a r a c a s e i M5 A L和 G 1 5 A L在 H T - 2 9 細(xì)胞上有較 強(qiáng)粘附能力( > 4 0 b a c t e r i ac e l l sp e r1 0 0H T - 2 9c e l l s ) ，并抑制病原微 生物 E c o l iA T C C

5、 2 5 9 2 2 、t y p h i m u r i u mA T C C1 4 0 2 8 、s o n n e iA T C C2 5 9 3 1 生長。4株菌活菌體 刺激 P B MC s 增殖，具有潛在免疫調(diào)節(jié)功能。關(guān)鍵詞： L a c t o b a c i l l u s ；益生菌；抑 菌；粘附；免疫 文章篇號：1 6 7 3 — 9 0 7 8 ( 2 0 1 2 ) 8 — 9 0 6 ． 9 1 0Ae s s

6、e s s m e n to ft h ePr o b i o t cP r o p e r t i e so fLa c t o b a c i l l u sS t r a i n sTUO Y a h ． f e n g， ZHANG W e i ' q i n， Z HANG La nwe i 3 ，AIL i a n - z h o n g 1( 1 ． B r i g h tD a i r yC o ． ， L

7、 t dS t a t eK e yL a b o r a t o r y o f Da i r yB i o t e c h n o l o g y , S h a n g ha i2 0 0 4 3 6 ， C h i n a )( 2 ． D e p a r t me n to f L i f eS c i e n c e ， T a f i m Un i v e r s i t y , A l a r8 4 3 3 0 0

8、， C h i n a )( 3 ． S c h o o lo f F o o dS c i e n c ea n dE n g i n e e r i n g ， Ha r b i nI n s t i t u t eo f T e c h n o l o g y , Ha r b i n1 5 0 0 9 0 ， C h i n a )Ab s t r a c t ： T h ef o u rL ． pa r a c a s e i

9、s u p s p ． p a r a c a s e is t a i n swe r ee x a mi n e di nv i t r oi nat wo — s t a g emo d e ls y s t e m c o mp r i s i n gs i mu l a t e dg a s t r i ca n di n t e s t i n a lj u i c e s ． ， a d h e s i o nc a p

10、 a b i l i t yt oH T - 2 9c e l l s ， a n t a g o n i s t i ca c t i v i t y a g a i n s te n t e r i cp a t h o g e n sa ndi mmu n o mo d u l a t i n ga c t i v i t y ． T h es t r a i nsL ． p a r a c a s e is u p s p ．

11、 p a r a c a s e iM5 A La n dJ 2 3 A N Lw e r ea b l et os u r v i v ei ns i mu l a t e dg a s t r oj u i c ew h i l et h es t r a i nsL ． p a r a c a s e is u p s p ．p a r a c a s e iG15 A La n dT 3 ALl o s tv i a b i l

12、 i t y e x p o s e dt os i mu l a t e dg a s t r oj u i c ef or3h ． T h ef ou r s t r a i n sh a dh i 曲 v i a b i l i t y i ns i mu l a t e ds ma l li n t e s t i n a lj u i c ew i t hl i t t l el o s sr4 0b a c t e r

13、 i ac e l l sp e r1 0 0H T - 2 9c e l l s ) ． T h es t r a i n sL ． p a r a c a s e is u p s p ． p a r a c a s e iM5 A La n dG1 5 A Lc o u l di n h i b i tt h eg r o wt ho ft heE． c o l iA T CC2 5 9 2 2 ， s ．t y p h i mu

14、 r i u m A T CC 1 4 0 2 8 ， S ． s o n n e iA TC C 2 5 9 3 1 ． T h el i v eb a c t e r i ao ft h ef ou rs t r a i n sc o u l de x e r tp r o l i f e r a t i v ee f e c to nP B MC s ．Ke ywo r d S _ - La c t o b a c i l

15、l u s ； p r o b i o t i c s ； a n t i mi c r o b i a la c t i v i t y ； a d h e r e n c e ； i mmt mi t yMe t c h n i k o f 在 1 9 0 8 年首次提出攝食發(fā)酵食品對人 體具有保健功能，而發(fā)酵食品的保健功能得益于其中的發(fā)酵微生物 ，現(xiàn) 己清楚發(fā)酵食品中的 L a c t o b a c i l l u s菌株對人體

16、具有多種保健功能，如提高機(jī)體免疫力，防止腸致病 性微 生物感染 、兒童 急性腹瀉【 JJ 。腸 道共生微 生物 與人體健康 休戚 相關(guān) ，保 持腸道 共生微生物平衡、抑制病原微生物在腸道內(nèi)過度繁殖 能夠 保持機(jī)體健康L 2 J 。L a c t o b a c i l l u s屬菌株通過在腸 道 內(nèi)產(chǎn)生有機(jī)酸降低腸道 p H值、產(chǎn)生 H 2 O 2 及細(xì)菌素等 抗菌物質(zhì)抑制病原菌在腸道 內(nèi)增生，從而維持腸道共 生菌群 平衡 。收稿 日

17、 期 ：2 0 1 2 — 0 6 - 0 4基金項(xiàng) 目：科 技部 9 7 3科 技計(jì)劃項(xiàng) 目 ( 2 0 1 0 C , B 7 3 5 7 0 5 ) ：教 育音 B 禾 } 學(xué)技術(shù)研 究 重 點(diǎn)項(xiàng) 目 ( 2 11 2 0 3 )腸道正常菌群對于腸相關(guān)淋巴組織的發(fā)育和免疫 平衡起到重要 作用 ，L a c t o b a c i l l u s 屬菌株通過維持腸道 正常微生物菌群使機(jī)體免疫系統(tǒng)處于健康狀態(tài)【 2 J 。 現(xiàn) 已證明

18、包~ i r i L a c t o b a c i l l u s 屬菌株在 內(nèi)的乳酸菌可以增強(qiáng)非 特 異性 免疫 ( 增強(qiáng)吞 噬功 能和 自然 殺傷細(xì)胞 活力 )和 特異性 免疫 ( 增 強(qiáng)抗體 的產(chǎn)生 ，增 強(qiáng)細(xì)胞 因子的表達(dá) ，使淋巴細(xì)胞增殖) L 3 J 。 動(dòng)物試驗(yàn)和人體試驗(yàn)均證明食用 乳酸菌可以調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能L 4 J 。本文評價(jià)4 株 從傳統(tǒng)發(fā)酵乳制 品中分離獲得 的L a c t o b a c i l l u s

19、菌株在模擬胃、腸道條件下的存活能力、腸上皮細(xì)胞上 的粘附能力、對致病菌的抑制作用及對 免疫細(xì)胞增殖 的影響，以期獲得具有潛在益生功能的 菌株 ?，F(xiàn)代食 品科 技 Mo d e r nF o o dS c i e n c ea n dT e c h n o l o g y2 0 1 2 ， V o 1 ． 2 8 ， N o ． 84 1 ～ 1 0 0 ，具有粘附能力；粘附的的菌株數(shù)量超過 1 0 0為強(qiáng)粘附能力。1 ． 2 ． 4

20、目 標(biāo)乳桿菌株菌體成分對人P B MC s 增殖的影響 采用I l i e v [ 8 ] 描述 的方法測定L a c t o b a c i l l u s 菌體成分 對 P B MC s 增殖 的影 響。調(diào) 節(jié) P B MC s濃 度 為 2 × 1 0 。細(xì) 胞 ／ m L，重 懸 于 R P MI 1 6 4 0 完全培養(yǎng)液中。 取 1 0 0上述 P B MC s 懸浮 液加入 9 6 孔培養(yǎng)板，每孔 1 0 0 g

21、 L 。用 R P MI 1 6 4 0 完全培養(yǎng)液分別將L a c t o b a c i l l u s 熱滅 活菌體細(xì)胞、活菌體細(xì)胞、菌體細(xì)胞壁 、基因組 D N A配制為懸浮液， 加入 9 6 孔培養(yǎng)板中， 每孔總體積為 11 0u L ，最終濃度見表 1 。陽性對照? L D H 入脂多糖 ( L P S )和伴刀豆 蛋 白 A ( C o n A) ，濃度 分別為 1~ e d mL 和 2~ g ／ m L 。陰性對照孔只

22、加入 P B MC s ，完全 R P MI 1 6 4 0補(bǔ)足 1 1 0。 試驗(yàn)孔、陽性對照孔、 陰性對照孔各做 6個(gè)平行。在 C O 2 培養(yǎng)箱 ( 5 ％C O 2 、9 5 ％空氣，1 0 0 ％濕 度， 3 7℃)培養(yǎng) 7 2 h 。 培養(yǎng)終止前 4 h ，培養(yǎng)板每孔中加入 MT T溶液 ( 5mg ／ m L，P B S ，p H 7 ． 4 )2 0，繼 續(xù)培養(yǎng) 4h 。向每孔中加入 1 5 0g L酸化異丙醇 ( S

23、 D S ，2 0 g ； 1M H C I ，2 mL ；H 2 0，1 0 0 mL )終止 培養(yǎng)；避 光 3 7℃溫育 3h ， 以溶 解 甲臌 ( F o r ma z a n ) 。然后用酶 標(biāo)儀測定培養(yǎng)板在 4 9 0n m 處吸光度值。細(xì)胞增 殖 系數(shù) ( S I )= ( 試驗(yàn) 孔吸光度值． 試劑 空白吸 光度 值1 ／ ( 細(xì)胞 空白吸光度值一 試劑空白吸光度值) 。表1不同劑量L a c t o b a c i ／

24、／菌體成分與人P B M C s 共同培養(yǎng) Ta b l e1P BM Csc o c u l t u r e dwi t hc e l l u l a rc o mp o n e n t so ft h es t r a i n sa td i fe r e n td o s a g e s1 ． 2 ． 5 統(tǒng)計(jì)分析 本研究中，每個(gè)試驗(yàn)做 3次重復(fù)。采用統(tǒng)計(jì)分析 軟件 S P S S1 4 ． 0f o rWi n d o wsE

25、v a l u a t i o nV e r s i o n ( S P S SI n c ， C h i c a g o ， U S A )對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理， 通過方差分 析 ( A N O V A)計(jì)算處理問差異顯著性，顯著水平為 0 ． 05。2 結(jié)果 與討論 2 ． 1 菌株在模擬胃腸液中存活結(jié)果 益生菌株需要以活菌體形態(tài)進(jìn)入腸道，才能更好 的發(fā)揮其對人體有益的功能。 人的胃每天會(huì)分泌大約 3Lp H2 ． 0的胃液，因此益生

26、菌株須具有一定的耐受低 p H 能力才能通過 胃、以活菌體形態(tài)進(jìn)入腸道。菌株 J 2 3 A NL 、M5 A L 、G1 5 A L 、T 3 A L 在模擬 胃液、腸液 中的存活情況 見表 2 。表2初篩菌株耐受模擬胃腸液試驗(yàn)結(jié)果 ( Io gc f u ／ m L )T a b l e2Vi a b l ec o u n t so ft h el a c t o b a c i U is t r a i n si nt h es

27、i mu l a t e dg a s t r i ca n ds ma l li nt e s t i n a lj u i c e4株 L a c t o b a c i l l u s 菌株耐受模擬 胃液 ( p H2 ． 0 ，含 3mg ／ mL 胃 蛋 白 酶 ) 的 能 力 具 有 較 大 的 差 異 。L a c t o b a c i l l u s 在 0h 每毫升菌落單位 ( c f u ／ m L )的 l o

28、g值在 8 ． 0 ～ 1 0 ． 0 之間， 在模擬胃液中暴露 1h 后， 所有菌 株每毫升菌落單位的 l o g 值均有所下降， l o g值下降的 范圍在 2 ． 7 5 ～ 3 ． 1 7 之間；當(dāng)菌株在模擬胃液中暴露的時(shí) 間增加到 3h ， l o g 值繼續(xù)下降， 下降的范圍在 3 ． 4 8 - 9 ． 1 6之間，菌株 G l 5 A L 、T 3 A L在模擬胃液中暴露 3h 后，不能檢測到活菌的存在。菌株在模擬胃液中

29、暴露時(shí)間越長，存活的菌數(shù)越 少 ，有 些菌株甚至在暴 露 3 h后全部死亡 ，低 p H值和 胃蛋白酶的存在對 L a c t o b a c i l l u s 具有殺傷作用， 這與文 獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果是相似的。L a c t o b a c i l l u s 在 p H8 ． 0 、 含 3mg ／ mL膽 鹽、 lmg ／ mL胰酶的模擬小腸液中暴露 4h ，每毫升菌落單位的 l o g值下降的程度較小，在 0 ． 1 8 ～ 0

30、． 4 1 之間。與模擬胃液相 比，模擬小腸液對大部分菌株的存活影響較小，說明胰酶和膽鹽對 L a c t o b a c i l l u s 的存活影響較小， 菌株能夠 在模擬小腸液中存活。大多數(shù) L a c t o b a c i l l u s 屬菌株具有較強(qiáng)耐酸能力， 可 以在 p H4 ． 6 條件下存活，發(fā)酵乳制品的最終 p H值為 4 ． 6 。人體胃液在未進(jìn)食的條件下 p H值是 1 ，進(jìn)食后，達(dá)到 4 ． 5 ，食物在

31、胃中消化約需 3 h 。在 p H1 條件下，大多數(shù) L a c t o b a c i l l u s 屬菌株在 1h 后便死亡；而在 p H2 ． 5 - 4條件下，大多數(shù)L a c t o b a c i l l u s 屬菌株 3h 后仍然 存活。益生菌一般同牛乳一同食用 ，牛乳中酪蛋 白可 以在胃環(huán)境中保護(hù)菌株免受低 p H的影響， 而且胃液本 身與模擬 胃液相 比，對菌株也有一定的保護(hù)作用 ，主 要 由胃液中的粘蛋 白 起到

32、保護(hù)作用J 。本研 究 中的 L a c t o b a c i l l u s菌株在模擬 胃液 中存活 率較低，而在模擬小腸液中有較高的存活率。因此在 L a c t o b a c i l l u s菌株暴露在 胃環(huán)境時(shí)，需要對其進(jìn)行保 護(hù)，可以同牛乳或其它食品共同服用，以緩沖胃酸對 菌株的損傷， 而 p H值較高的腸道環(huán)境不會(huì)對菌株的活 力造成不利的影響。 本研究中L a c t o b a c i l l u s 在真實(shí)胃 環(huán)