白鰱p38 MAPK,C-fos,C-jun基因克隆及其微囊藻毒素暴露后的表達(dá)分析.pdf

1、絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，參與生物體多種生理和病理過(guò)程的調(diào)節(jié)。p38 MAPK是MAPK通路的重要成員之一，它可被細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和胞外多種刺激（環(huán)境壓力、紫外線、放射線、熱休克、炎癥因子、特定抗原等）所活化，并參與細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)傳遞過(guò)程。
　　原癌基因c-fos、c-jun、c-myc屬即刻早期基因(Immediately Early Genes，IEGs)成員。目前已發(fā)現(xiàn)的IEGs有十

2、幾種，其中c-fos、c-jun基因被廣泛用作外界刺激后神經(jīng)元活化的標(biāo)記，在細(xì)胞活動(dòng)中起著重要的調(diào)控作用。
　　本研究首次克隆了白鰱肝臟p38 MAPK、c-fos和c-jun基因cDNA全長(zhǎng)并進(jìn)行了序列分析，同時(shí)檢測(cè)了微囊藻毒素(Microcystins，MC)對(duì)白鰱的急性毒性作用及其腹腔注射染毒后白鰱肝臟和腎臟p38 MAPK、c-fos、c-jun和c-myc的表達(dá)分析。
　　本研究利用RT-PCR和RACE技術(shù)擴(kuò)增得

3、到p38 MAPK、c-fos、c-jun基因的cDNA全序列。序列分析結(jié)果表明，白鰱肝臟p38 MAPK基因序列全長(zhǎng)2418 bp，開(kāi)放閱讀框1086 bp，編碼361個(gè)氨基酸;c-fos基因序列全長(zhǎng)為1719 bp，開(kāi)放閱讀框1059 bp，編碼352個(gè)氨基酸;c-jun cDNA全長(zhǎng)1931 bp，開(kāi)放閱讀框927 bp，編碼308個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，白鰱p38 MAPK蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為41.64 kD，理論等電點(diǎn)為5

4、.54，該蛋白是一個(gè)不穩(wěn)定蛋白，具有較強(qiáng)的親水性。c-Fos蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為38.242 kD，理論等電點(diǎn)為4.93，該蛋白是一個(gè)不穩(wěn)定蛋白且具有較強(qiáng)的親水性。c-Jun蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為33.928 kD，理論等電點(diǎn)為9.08，是一個(gè)不穩(wěn)定蛋白且具有一定的親水性。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，p38 MAPK包含45.71％α-螺旋、13.02％的延伸鏈、4.99％的β-折疊和36.29％的無(wú)規(guī)則卷曲;c-Fos包含25.85％的α-螺旋、12

5、.78％的延伸鏈、1.42％的β-折疊和59.94％的無(wú)規(guī)則卷曲;c-Jun包含32.14％的α-螺旋、5.52％的延伸鏈、1.62％的β-折疊和60.71％的無(wú)規(guī)則卷曲。
　　對(duì)其功能結(jié)構(gòu)位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，p38 MAPK在35～309 aa之間存在一個(gè)保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶區(qū);c-Fos和c-Jun分別在108～172 aa和227～291 aa處有一個(gè)典型的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)。通過(guò)構(gòu)建氨基酸系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，白鰱p38 MAPK與鯉

6、魚(yú)同源性高達(dá)96％，白鰱c-Fos與草魚(yú)c-Fos同源性高達(dá)97％，白鰱c-Jun與草魚(yú)c-Jun同源性高達(dá)95％，與哺乳動(dòng)物同源性相對(duì)較低。
　　另外，qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示p38 MAPK、c-fos和c-jun在白鰱各個(gè)組織均有表達(dá)，其中p38 MAPK表達(dá)量高低依次是肌肉＞腸＞脾＞腎＞鰓＞肝＞心＞腦;c-fos表達(dá)量高低依次是肝＞脾＞腎＞腸＞肌肉＞鰓＞腦＞心;c-jun表達(dá)量高低依次是肝＞腸＞心＞腦＞脾＞腎＞肌肉＞鰓。

7、>　　通過(guò)上下增減劑量法(up and down procedure，UDP)對(duì)白鰱進(jìn)行MC急性毒性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，MC對(duì)白鰱48 h LDs0為520μg·Kg-1。根據(jù)半致死劑量選取50和200μg·Kg-1濃度組MC腹腔注射暴露白鰱，分別于1、3、8和12h后取材白鰱肝、腎組織，提取RNA，通過(guò)qPCR檢測(cè)白鰱p38 MAPK、c-fos、c-jun和c-myc基因的表達(dá)變化，結(jié)果表明，MC對(duì)其表達(dá)都有明顯的誘導(dǎo)作用，推測(cè)白鰱p3