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1、東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense Lu)和鏈狀亞歷山大藻(Alexandrium catenella)是我國(guó)近海兩種主要有害赤潮生物,在東南沿海常形成大規(guī)模的赤潮,已對(duì)近海生態(tài)系統(tǒng)、沿海養(yǎng)殖業(yè)、人民健康和生命財(cái)產(chǎn)安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。 本論文以這兩種赤潮生物為模式種,引入現(xiàn)代蛋白質(zhì)組學(xué)概念及技術(shù),比較了四種蛋白質(zhì)提取方法,建立了用于赤潮生物蛋白質(zhì)組學(xué)研究的總蛋白質(zhì)提取方法:研究了兩種亞歷山大藻蛋白質(zhì)組
2、的差異,確認(rèn)了種間特異性指示蛋白;比較研究了不同生長(zhǎng)期和生長(zhǎng)條件下,赤潮生物蛋白質(zhì)組的差異表達(dá),確認(rèn)、鑒定了一批特異性生理指示生物標(biāo)志物,探討了它們?cè)诔喑鄙锷顒?dòng)及赤潮形成中的作用。取得的主要結(jié)果如下: 1.建立和優(yōu)化了用于赤潮生物蛋白質(zhì)組學(xué)研究的總蛋白提取方法。比較研究了四種蛋白質(zhì)提取方法:曲拉通100—尿素提取法、三氯乙酸—丙酮沉淀法、40mMTris—5%甘油提取法和40mMTris提取法的蛋白提取效果。結(jié)果表明,曲
3、拉通100—尿素提取法的蛋白提取效果最好,蛋白點(diǎn)分離清晰,蛋白點(diǎn)數(shù)多(可達(dá)上千點(diǎn)),而且未造成堿性蛋白和高分子量蛋白的丟失。該方法提取過程簡(jiǎn)單,操作簡(jiǎn)便,為開展赤潮藻生物蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了一種高效、簡(jiǎn)便的方法; 2.結(jié)合形態(tài)分類學(xué)和分子生物學(xué)方法,比較研究了我國(guó)近海兩種主要赤潮生物塔瑪亞歷山大藻A.tamarense DH01和鏈狀亞歷山大藻A.catenella DH01蛋白質(zhì)組的差異表達(dá),發(fā)現(xiàn)它們的蛋白2—DE圖譜相似性
4、達(dá)99%,在分類上,這兩種亞歷山大藻應(yīng)屬于同一種藻。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了一些特異性表達(dá)蛋白,如A.tamarense DH01中的AT1—5,A.catenella DH01中的AC1—3,它們可作為種內(nèi)鑒定的一類特異性生物標(biāo)志物; 3.比較研究了不同生長(zhǎng)時(shí)期東海原甲藻和鏈狀亞歷山大藻蛋白質(zhì)組的差異表達(dá),發(fā)現(xiàn)了一些與細(xì)胞生長(zhǎng)周期相關(guān)的生物標(biāo)志物:在東海原甲藻中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的cdc2蛋白激酶1,該蛋白在指數(shù)生長(zhǎng)期的藻細(xì)胞
5、中表達(dá)明顯,在消亡期表達(dá)量明顯下降,一些蛋白,如17—19號(hào)(RubisCo),21、23-26、28、30號(hào),在消亡期幾乎不表達(dá);在鏈狀亞歷山大藻種也發(fā)現(xiàn)了多個(gè)蛋白,31—35,46—48、61—70號(hào)蛋白在消亡期表達(dá)量明顯下降。這些蛋白可作為指示細(xì)胞不同生長(zhǎng)期的一類潛在的特異性生物標(biāo)志物; 4.比較不同營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)下的細(xì)胞蛋白質(zhì)組的差異表達(dá)發(fā)現(xiàn),在氮或磷限制的條件下,東海原甲藻細(xì)胞中的一些蛋白,如PC1、PC3、PC5和PC7
6、—9不表達(dá),而一組酸性蛋白,PC2表達(dá)明顯增加,這些蛋白可作為指示氮或磷限制的生物標(biāo)志物;而一些蛋白僅在氮限制時(shí)表達(dá)明顯減弱(PC4、PC6)或不表達(dá)(PP1—3),這些蛋白可作為指示氮限制的生物標(biāo)志物:在鏈狀亞歷山大藻中也發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與氮限制相關(guān)的蛋白AN1:一些蛋白,如AN1—5、AP1和AC1在添加氮或磷后表達(dá)明顯增強(qiáng),并在藻細(xì)胞處于良好生長(zhǎng)狀態(tài)時(shí)也有很強(qiáng)的表達(dá),這些蛋白可作為指示藻細(xì)胞處于良好營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的生物標(biāo)志物; 5.
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