聚合物接枝型疏水性電荷誘導層析介質設計及蛋白質吸附機理研究.pdf

1、疏水性電荷誘導層析(Hydrophobic charge-induction chromatography，HCIC)是一種新型抗體分離技術，其配基兼有疏水、靜電、氫鍵等多種相互作用，具有選擇性好、耐鹽性高、洗脫條件溫和以及價格相對低廉等特點，已有一些成功應用實例。由于配基與抗體結合力較弱，使得HCIC介質在高流速下對抗體的動態(tài)結合載量較低，而聚合物接枝的離子交換層析介質可以顯著提高蛋白的吸附容量、傳質速率和動態(tài)結合載量。因此本文以高效

2、抗體分離為目標，設計并制備了兩種聚合物接枝型HCIC介質，比較蛋白吸附和傳質性能，分析層析過程的固相條件（聚合物接枝、配基密度、接枝密度）和液相條件（pH和添加鹽）的影響，并借助逆體積排阻層析(Inverse size exclusion chromatography，ISEC)、等溫滴定量熱儀(Isothermaltitration calorimetry，ITC)和共聚焦激光掃描顯微鏡(Confocal laser scanning

3、microscopy，CLSM)進行了微觀分析，以指導新型介質設計。主要結果如下:
　　首先以葡聚糖接枝的瓊脂糖凝膠為基質，以2-巰甲基咪唑(MMI)為配基，優(yōu)化了配基偶聯(lián)條件，制備了不同配基密度的葡聚糖接枝MMI介質。相比非接枝MMI介質，配基密度提高了50％左右，達到200μmol/g。以hIgG為模型蛋白，考察了系列葡聚糖接枝MMI介質的靜態(tài)吸附、吸附動力學和層析柱動態(tài)吸附性能。結果表明，在近中性pH下，葡聚糖接枝介質對蛋白

4、的吸附容量、結合力、傳質速率和動態(tài)結合載量隨著配基密度增加而持續(xù)增加，葡聚糖接枝MMI介質相比非接枝MMI介質具有更高的蛋白吸附容量、傳質速率和動態(tài)結合載量。在pH7.0～8.9時，飽和吸附容量保持在107.5～110.0 mg/g，受pH影響較小;在100 cm/h線性流速下hIgG動態(tài)結合載量達到38.3 mg/g;在弱酸性條件下，葡聚糖接枝MMI介質的蛋白吸附容量和傳質速率下降更顯著，有利于蛋白解吸。此外，葡聚糖接枝MMI介質吸附

5、能力受鹽濃度的影響較小，但傳質速率受鹽濃度的影響較大。
　　其次，針對葡聚糖接枝介質中HCIC配基同時存在于接枝層和基質孔道表面上的局限，利用表面引發(fā)的電子轉移再生活化劑的原子轉移自由基聚合反應，制備了不同接枝密度和配基密度的聚甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)接枝MMI介質。結果表明，高接枝密度和中等配基密度的聚GMA接枝MMI介質對hIgG具有更高的飽和吸附容量和傳質速率。相比葡聚糖接枝MMI介質以及商業(yè)化HCIC介質MEPHyp

6、erCel，聚GMA接枝介質對hIgG具有更高動態(tài)結合載量。hIgG動態(tài)結合載量受流速影響較小，線性流速300 cm/h下可達34.6 mg/g，且具有明顯的pH依賴吸附和耐鹽吸附特性。此外，考察了從混合蛋白體系（hIgG/HSA=1∶4）中分離hIgG和從CHO細胞培養(yǎng)液中分離單克隆抗體，聚GMA接枝HCIC介質均表現出良好的抗體分離和重復使用性能，50個周期循環(huán)使用的抗體純度和收率分別穩(wěn)定在98.5～99.8％和90.2～96.9％

7、。
　　最后，為了從微觀尺度揭示聚合物接枝MMI介質的吸附及傳質機制，利用ISEC考察了介質孔結構的影響，利用ITC研究了不同蛋白（hIgG和BSA）的吸附熱，利用CLSM實時觀測了單個介質顆粒內蛋白的吸附、傳質及洗脫過程。ISEC結果表明，不加鹽時葡聚糖接枝鏈和聚GMA接枝鏈在基質表面形成三維空間分布，有助于提高蛋白吸附容量;高鹽濃度下，接枝鏈出現塌縮，且葡聚糖鏈的塌縮程度更明顯，削弱了鏈傳遞效應，降低了蛋白傳質速率。ITC結果

8、表明，對于hIgG，在pH8時，配基密度和鹽濃度的增加會顯著增加葡聚糖接枝MMI介質吸附hIgG的焓變和熵變，說明疏水相互作用增強;弱酸條件下，焓變和熵變急劇下降為負值，說明靜電排斥作用主導了蛋白的解吸;對于BSA，吸附容量隨著鹽濃度的增加而顯著下降，且焓變和熵變值為負，表明主要通過靜電吸引力吸附BSA。CLSM結果表明，hIgG和BSA在葡聚糖接枝、聚GMA接枝和非接枝MMI介質內，均體現出均質擴散控制的傳質機理;hIgG在高配基密度

9、葡聚糖接枝和中等配基密度聚GMA接枝MMI介質內體現了更高的熒光強度;相比hIgG，BSA達到MMI介質內核所需時間更短;pH4.0時，中等配基密度聚GMA接枝MMI介質內的熒光強度下降最為明顯;以上結果與宏觀吸附、傳質及分離性能相匹配。
　　本文從提高HCIC介質的蛋白載量出發(fā)，制備了兩種新型聚合物接枝HCIC介質，探討了聚合物接枝、配基密度、接枝密度、pH、添加鹽和蛋白性質對聚合物接枝HCIC介質吸附和傳質性能的影響，并利用I