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文檔簡介
1、單克隆抗體是一類重要的生物技術(shù)藥物,具有巨大的市場前景。基于蛋白A親和層析的抗體分離過程存在一些局限,制約了抗體產(chǎn)業(yè)發(fā)展,開發(fā)經(jīng)濟高效的抗體分離新方法,具有重要的意義。疏水性電荷誘導(dǎo)層析(HCIC)是抗體分離的新方法,不過相關(guān)機制的認識仍不夠深入,分離工藝尚待完善,配基性能也有待提高。本論文以抗體分離為目標,結(jié)合實驗手段和計算機分子模擬方法,分析HCIC分離的分子機制,設(shè)計新型配基,探討HCIC分離抗體的新工藝。
首先比較了H
2、CIC介質(zhì)(MEP HyperCel和Bestarose-4FF-MMI)和蛋白A親和介質(zhì)的吸附分離性能,進行了單抗分離工藝的優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后的HCIC抗體分離工藝與蛋白A親和層析的效果接近,但仍有進一步提升的空間。進一步以牛血清白蛋白(BSA)為典型雜質(zhì),系統(tǒng)考察了溶液條件(pH、鹽以及添加辛酸鈉等)對蛋白吸附和解吸行為的影響,探討了蛋白和MEP配基間的相互作用。通過調(diào)節(jié)pH、離子強度和添加辛酸鈉可以顯著提高HCIC結(jié)合抗體的選擇性,
3、有效降低BSA在HCIC介質(zhì)上的吸附,提高抗體分離的效率。
采用計算機分子模擬方法探討了HCIC配基和抗體間的相互作用,從分子尺度揭示了HCIC的分離機制。結(jié)果表明,抗體分子上存在多個可能的結(jié)合位點,疏水相互作用、pi-pi、pi-陽離子以及氫鍵作用在配基-抗體結(jié)合過程中起了重要作用。證實了高配基密度對抗體吸附的重要性,并觀察到類似于誘導(dǎo)契合的蛋白構(gòu)象調(diào)整,以及典型的多位點協(xié)同作用。酸性條件下,堿性氨基殘基與質(zhì)子化的HCIC配
4、基間存在靜電排斥力,是蛋白解吸的主要推動力。
通過分子動力學模擬研究了抗體的Fc片段和天然的Fc特異性配基間分子識別和結(jié)合模式。結(jié)果顯示,疏水作用是特異性配基結(jié)合的主要驅(qū)動力。進一步通過丙氨酸掃描方法,分析比較了配基-抗體間的相互作用能,鑒別出配基和Fc結(jié)合界面上的熱點殘基,提出了基于色氨酸或酪氨酸殘基的兩種結(jié)合模式,為仿生Fc親和配基的設(shè)計提供了指導(dǎo)。
設(shè)計了兩種HCIC新配基:氨基苯并咪唑(ABM)和色氨酸-氨基
5、苯并咪唑雙功能配基(W-ABM),成功偶聯(lián)于瓊脂糖凝膠,制備了新型HCIC介質(zhì),考察了吸附性能,并用于抗體分離。結(jié)果表明,在中性pH范圍內(nèi),兩種介質(zhì)對IgG具有較高的飽和吸附容量,對BSA吸附量低,且對抗體吸附具有顯著的非鹽依賴特性。在弱酸性pH條件下,能夠?qū)崿F(xiàn)抗體的有效回收。兩種介質(zhì)的動態(tài)載量受流速影響較小,在高流速下仍能維持較高的載量,性能優(yōu)于商業(yè)化的MEPHyperCel介質(zhì)。進一步實現(xiàn)了模擬血清和細胞培養(yǎng)上清液中分離抗體,結(jié)果表
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