新型疏水性電荷誘導配基設計及層析分離抗體研究.pdf

1、單克隆抗體是一類重要的生物技術藥物，具有巨大的市場前景?；诘鞍譇親和層析的抗體分離過程存在一些局限，制約了抗體產業(yè)發(fā)展，開發(fā)經濟高效的抗體分離新方法，具有重要的意義。疏水性電荷誘導層析(HCIC)是抗體分離的新方法，不過相關機制的認識仍不夠深入，分離工藝尚待完善，配基性能也有待提高。本論文以抗體分離為目標，結合實驗手段和計算機分子模擬方法，分析HCIC分離的分子機制，設計新型配基，探討HCIC分離抗體的新工藝。
　　首先比較了H

2、CIC介質（MEP HyperCel和Bestarose-4FF-MMI）和蛋白A親和介質的吸附分離性能，進行了單抗分離工藝的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后的HCIC抗體分離工藝與蛋白A親和層析的效果接近，但仍有進一步提升的空間。進一步以牛血清白蛋白(BSA)為典型雜質，系統(tǒng)考察了溶液條件（pH、鹽以及添加辛酸鈉等）對蛋白吸附和解吸行為的影響，探討了蛋白和MEP配基間的相互作用。通過調節(jié)pH、離子強度和添加辛酸鈉可以顯著提高HCIC結合抗體的選擇性，

3、有效降低BSA在HCIC介質上的吸附，提高抗體分離的效率。
　　采用計算機分子模擬方法探討了HCIC配基和抗體間的相互作用，從分子尺度揭示了HCIC的分離機制。結果表明，抗體分子上存在多個可能的結合位點，疏水相互作用、pi-pi、pi-陽離子以及氫鍵作用在配基-抗體結合過程中起了重要作用。證實了高配基密度對抗體吸附的重要性，并觀察到類似于誘導契合的蛋白構象調整，以及典型的多位點協(xié)同作用。酸性條件下，堿性氨基殘基與質子化的HCIC配

4、基間存在靜電排斥力，是蛋白解吸的主要推動力。
　　通過分子動力學模擬研究了抗體的Fc片段和天然的Fc特異性配基間分子識別和結合模式。結果顯示，疏水作用是特異性配基結合的主要驅動力。進一步通過丙氨酸掃描方法，分析比較了配基-抗體間的相互作用能，鑒別出配基和Fc結合界面上的熱點殘基，提出了基于色氨酸或酪氨酸殘基的兩種結合模式，為仿生Fc親和配基的設計提供了指導。
　　設計了兩種HCIC新配基:氨基苯并咪唑（ABM）和色氨酸-氨基

5、苯并咪唑雙功能配基(W-ABM)，成功偶聯(lián)于瓊脂糖凝膠，制備了新型HCIC介質，考察了吸附性能，并用于抗體分離。結果表明，在中性pH范圍內，兩種介質對IgG具有較高的飽和吸附容量，對BSA吸附量低，且對抗體吸附具有顯著的非鹽依賴特性。在弱酸性pH條件下，能夠實現(xiàn)抗體的有效回收。兩種介質的動態(tài)載量受流速影響較小，在高流速下仍能維持較高的載量，性能優(yōu)于商業(yè)化的MEPHyperCel介質。進一步實現(xiàn)了模擬血清和細胞培養(yǎng)上清液中分離抗體，結果表