疏水性電荷秀導層析分離抗體的分子模擬研究.pdf

1、疏水性電荷誘導層析(HCIC)是一項新型生物分離技術(shù)，在抗體分離中得到應用，但目前對HCIC配基-抗體間相互作用的分子機制認識還十分缺乏，“疏水性電荷誘導”的概念也僅停留在宏觀吸附實驗的表征，缺少配基與蛋白的作用位點、作用方式等相關(guān)信息，計算機分子模擬方法的發(fā)展為這方面的研究提供了有效工具。本文主要采用分子模擬方法探討HCIC分離抗體的分子機制，取得主要結(jié)果如下：
　　 首先結(jié)合分子對接和分子動力學(MD)模擬，考察了典型HCI

2、C配基--4-巰乙基吡啶(MEP)與IgG分子Fc片段之間的相互作用。通過分子對接搜索得到Fc-A鏈蛋白表面12個可能與MEP結(jié)合的位點，用MD模擬考察了其中6個位點的結(jié)合性能。發(fā)現(xiàn)MEP配基能穩(wěn)定結(jié)合在Fc-A鏈TYR319和LEU309附近位點1的疏水口袋上，并與二者形成氫鍵作用。pH4.0酸性條件下，原先穩(wěn)定結(jié)合在位點1的MEP快速從Fc-A鏈表面脫離，主要原因是MEP和Fc-A間的靜電排斥作用。該結(jié)果從分子水平驗證了HCIC獨特

3、的作用機理：疏水相互作用主導吸附，靜電排斥作用協(xié)助解吸。
　　 進一步考察了配基中空間臂、硫醚硫原子和雜環(huán)等功能基團對蛋白結(jié)合的影響。結(jié)果表明，含有砜基的空間臂能與蛋白表面的氨基酸殘基形成氫鍵，從而加強配基與蛋白的結(jié)合，但在洗脫時，這種氫鍵反而不利于蛋白的解離。模擬中未觀察到硫醚硫原子對吸附的特殊貢獻，可以用氧原子或氮原子替代。不同的雜環(huán)類型會影響配基與蛋白的結(jié)合，能量分析表明，與蛋白間范德華相互作用能的強弱順序依次為：2-巰基

4、苯并咪唑(MBI)＞MEP＞2-巰基-1-甲基咪唑(MMI)＞3-巰基-1，2，4-三氮唑(MTR)，與配基疏水性強弱的順序一致。pH4.0酸性條件下，帶正電荷的MMI和MBI很快從Fc-A表面解吸，但仍呈電中性的配基能繼續(xù)結(jié)合在原疏水口袋上。為使模擬更加接近真實層析條件，進一步引入纖維素基質(zhì)模型，構(gòu)建了纖維素基質(zhì)平面-配基模擬體系，考察了Fc-A鏈在固定化MEP配基上的吸附性能。在模擬進行的4ns時間尺度內(nèi)，F(xiàn)c-A能穩(wěn)定地通過位點1

5、的疏水口袋結(jié)合在固定化MEP單一配基或配基網(wǎng)上。這些模擬結(jié)果有助于解釋HCIC實驗中的諸多現(xiàn)象。
　　 最后結(jié)合靜態(tài)吸附實驗和等溫滴定量熱實驗，研究了以IgG為主要成分的人γ球蛋白在MEP HyperCel介質(zhì)上吸附的焓變(-1.68kcal/mol)、熵變(7.56cal/(mol·K)）和吉布斯自由能變(-3.93kcal/mol)等熱力學參數(shù)，并由此推斷驅(qū)動IgG在MEP配基上吸附的主要作用力為疏水相互作用，此外還包括范德