22888.抗體分離純化用層析介質(zhì)的研究

1、專業(yè)學(xué)位碩士學(xué)位論文抗體分離純化用層析介質(zhì)的研究Developmentofchromatographymatricesforantibodypurification作者姓名：萱建邊專業(yè)(工程領(lǐng)域)：生物工程學(xué)號(hào)：31218027指導(dǎo)教師：矍逮亟塾援一完成日期：大連理工大學(xué)DalianUniversityofTechnology大連理工大學(xué)專業(yè)學(xué)位碩士學(xué)位論文摘要色譜技術(shù)是目前抗體工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中的核心環(huán)節(jié)，而質(zhì)優(yōu)、價(jià)廉的層析介質(zhì)是保障抗

2、體生產(chǎn)效率和過(guò)程經(jīng)濟(jì)性的基礎(chǔ)。目前，抗體大規(guī)模生產(chǎn)過(guò)程中主要存在兩個(gè)突出問(wèn)題顯著影響產(chǎn)品回收率和生產(chǎn)成本：(1)單鏈抗體在原核表達(dá)過(guò)程中存在核酸去除困難的問(wèn)題，嚴(yán)重影響產(chǎn)品收率。由于單鏈抗體是典型的堿性蛋白質(zhì)(等電點(diǎn)為90)，與核酸分子間存在較強(qiáng)的靜電吸附，利用傳統(tǒng)的聚乙烯亞胺(PEI)沉淀核酸時(shí)，單鏈抗體易出現(xiàn)共沉淀析出，造成蛋白損失。(2)傳統(tǒng)抗體的精分離過(guò)程依賴于蛋白A親和純化過(guò)程，其高昂的成本是目前抗體類產(chǎn)品價(jià)格居高不下的主要原

3、因，而基因重組蛋白A和進(jìn)口瓊脂糖凝膠是造成這類層析介質(zhì)高成本的主要因素。本論文圍繞以上兩個(gè)問(wèn)題展開工作，具體研究?jī)?nèi)容包括：瓊脂糖凝膠的制備和粒徑控制；強(qiáng)陰離子交換介質(zhì)的制備及其在去除核酸，純化單鏈抗體中的應(yīng)用：基于4一巰基乙基吡啶(MEP)的疏水電荷誘導(dǎo)層析介質(zhì)作為“仿生蛋白A”的基質(zhì)材料優(yōu)化及其在抗體純化中的效果比較。主要內(nèi)容和結(jié)果如下：采用反相懸浮攪拌的方法制備了瓊脂糖凝膠，通過(guò)研究交聯(lián)及篩分的方法，獲得了具有較好物化穩(wěn)定性的瓊脂糖

4、微球。研究發(fā)現(xiàn)，采用加水靜置可有效破壞乳化平衡，獲得較好的破乳效果，有效縮短后處理時(shí)間，降低有機(jī)溶劑用量；采用200目篩網(wǎng)，經(jīng)過(guò)4輪篩分，所獲得的交聯(lián)瓊脂糖凝膠具有合適的粒徑分布。以瓊脂糖凝膠為基質(zhì)合成強(qiáng)陰離子核酸吸附劑。實(shí)驗(yàn)對(duì)比了不同活化劑對(duì)基質(zhì)活化密度的影響，之后以乙二胺為連接臂，采用縮合反應(yīng)偶聯(lián)甜菜堿，獲得了不同配基密度的強(qiáng)陰離子吸附劑。較優(yōu)的處理?xiàng)l件為pH為85，NaCl濃度為10mol／L，吸附劑用量為034g／ml發(fā)酵細(xì)胞破

5、碎上清時(shí)，可以獲得較好的核酸去除效果，此時(shí)，核酸去除率大于98％，目的蛋白損失少于10％。實(shí)驗(yàn)分別以瓊脂糖、纖維素和聚乙烯醇三種微球介質(zhì)為基質(zhì)合成了MEP疏水電荷誘導(dǎo)層析介質(zhì)，比較了它們的結(jié)構(gòu)性能和抗體分離效果。研究發(fā)現(xiàn)，瓊脂糖凝膠和纖維素球基質(zhì)具有類似的化學(xué)性質(zhì)，其較優(yōu)的合成方法為：活化時(shí)間為8h，NaOH濃度為10mol／L，活化劑用量為o08mL／g，N一溴代琥珀酰亞胺用量為008g／mL，溴化反應(yīng)時(shí)間為lh，MEP用量達(dá)到O06

6、g／ggel，偶聯(lián)時(shí)間為20h，偶聯(lián)pH為10；聚乙烯醇基質(zhì)較優(yōu)的合成方法為：活化時(shí)間為20h，NaOH濃度為12mol／L，活化劑用量為010mL／ggel，溴化反應(yīng)時(shí)間為1h，MEP用量達(dá)到O04edggel，偶聯(lián)時(shí)間為20h，偶聯(lián)pH為lO。三種基質(zhì)的吸附劑對(duì)人IgG的吸附容量分別為326mg／mL、294mg／mL和190mg／mL，對(duì)人血清中抗體組分的一步純度均可達(dá)到70％以上。關(guān)鍵詞：抗體分離；色譜基質(zhì)；甜菜堿；4一巰基乙基