以四肽為配基的仿生層析和抗體的分離純化.pdf

1、抗體是一類重要的生物技術(shù)藥物，具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，蛋白A親和層析是抗體分離的平臺(tái)技術(shù)，具有高度特異性，但是存在成本高、洗脫條件苛刻、蛋白配基易脫落等問(wèn)題。尋求經(jīng)濟(jì)高效的抗體分離新方法，具有重要的意義?；旌夏Ｊ綄游龊投屉姆律鷮游鍪悄壳翱贵w分離的新，目前對(duì)其的認(rèn)識(shí)還不夠深入。本論文以抗體的高效分離為目標(biāo)，以混合模式層析介質(zhì)分離抗體為起步，比較和評(píng)價(jià)混合模式配基在分離抗體時(shí)的作用和效果，然后分子對(duì)接比較混合模式配基和短肽配基，得出短肽配

2、基對(duì)抗體具有更好的選擇性。利用分子模擬分析短肽配基-抗體相互作用，以此作為設(shè)計(jì)四肽配基庫(kù)的重要依據(jù)，篩選出相應(yīng)的四肽配基，用于制備以新型四肽為配基的仿生層析介質(zhì)，以提高抗體的分離性能。
　　首先比較了四種商業(yè)化混合模式介質(zhì)對(duì)抗體的分離性能，分別是BestaroseDiamond MMA、Bestarose Diamond MMC、MEP HyperCel和PPA HyperCel。以人免疫球蛋白(hIgG)和牛血清白蛋白(BSA)

3、混合料液為分離對(duì)象，采用上述四種介質(zhì)進(jìn)行了分離純化的比較。pH梯度洗脫結(jié)果表明，Bestarose DiamondMMA抗體分離效果最好，經(jīng)進(jìn)一步優(yōu)化pH階躍洗脫，發(fā)現(xiàn)在用pH5.0進(jìn)行洗脫時(shí)，hIgG純度和收率分別達(dá)到了97.9％和92.8％。即使上樣量從1mL升至10mL，hIgG仍能維持滿意的純度和收率。另一方面，通過(guò)調(diào)控鹽濃度也可實(shí)現(xiàn)抗體的有效分離，當(dāng)平衡緩沖液中添加0.5M氯化鈉時(shí)，hIgG純度和收率可分別達(dá)到95.4％和90

4、.1％。由此證明混合模式層析分離抗體的可行性，為新型小分子配基的設(shè)計(jì)提供依據(jù)。
　　其次，利用分子對(duì)接，探討了小分子配基與抗體相互作用，發(fā)現(xiàn)短肽配基比混合模式配基具有更好的抗體選擇性。以短肽配基DAAG為模型，結(jié)合分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬，探討了DAAG與IgG-Fc片段的相互作用機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DAAG配基能夠與保守結(jié)合區(qū)域充分結(jié)合，實(shí)現(xiàn)幾何匹配和能量匹配。在中性條件(pH7.0)下，DAAG配基和Fc-A片段的結(jié)合包括多種作用

5、力，如離子鍵、疏水作用、氫鍵、范德華力和pi-陽(yáng)離子作用等，實(shí)現(xiàn)了配基的強(qiáng)親和力和高選擇性。在酸性條件下，DAAG配基與Fc-A片段之間存在排斥力，減弱了吸引力，導(dǎo)致配基從蛋白表面解離。基于配基-抗體間分子作用力的綜合分析，提出了短肽仿生配基的設(shè)計(jì)模式，指導(dǎo)新型短肽仿生配基的設(shè)計(jì)。
　　第三，基于上述分子模擬結(jié)果和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)了四肽配基庫(kù)，Ac-HN-Aro-Aro-R-Aro/Ali-COOH。利用柔性對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬，實(shí)

6、現(xiàn)雙重篩選，確定最佳四肽配基為Ac-YFRH。以氨基活化瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，采用HATU化學(xué)合成，實(shí)現(xiàn)四肽配基的高效偶聯(lián)，制備了新型Ac-YFRH四肽介質(zhì)。靜態(tài)平衡吸附表明，介質(zhì)對(duì)hIgG吸附量隨pH降低而降低，且具有較好的非鹽依賴吸附能力。以hIgG和BSA混合溶液為模擬料液，在1M氯化鈉的中性條件下吸附，pH5.0洗脫，hIgG純度和收率分別達(dá)到98.4％和89.4％，表明新型四肽仿生層析介質(zhì)具有良好的抗體分離性能。
　　最后，

7、制備不同配基密度的Ac-YFRH四肽介質(zhì)，考察了系列介質(zhì)對(duì)hIgG的吸附和分離性能，探討了鹽濃度對(duì)靜態(tài)吸附容量，吸附動(dòng)力學(xué)和動(dòng)態(tài)載量的影響。結(jié)果表明，隨配基密度上升，hIgG靜態(tài)吸附容量增大，而表觀解離常數(shù)減小;孔擴(kuò)散模型能較好地?cái)M合hIgG的吸附動(dòng)力學(xué)曲線，但也發(fā)現(xiàn)蛋白的表面結(jié)合阻力對(duì)吸附的影響較大。穿透實(shí)驗(yàn)表明，介質(zhì)對(duì)hIgG的動(dòng)態(tài)載量也隨著配基密度的增加而增加。在高流速下，介質(zhì)對(duì)hIgG的動(dòng)態(tài)載量較低;而在中低流速下，動(dòng)態(tài)載量變化

8、較小，且達(dá)到靜態(tài)吸附容量的41.2％。考察了采用101μmol/g配基密度的四肽層析介質(zhì)分離復(fù)雜料液的效果，包括牛乳清中分離牛免疫球蛋白(bIgG)和CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分離單克隆抗體。當(dāng)層析柱保留時(shí)間為3分鐘時(shí)，介質(zhì)對(duì)bIgG和單抗的動(dòng)態(tài)載量分別為1.6mg/mL介質(zhì)和12.5mg/mL介質(zhì)。經(jīng)優(yōu)化上樣和洗脫條件，bIgG純度和收率分別為84.3％和86.9％，單抗純度和收率分別為95.7％和86.2％。這些結(jié)果充分顯示了新型四肽層