金華火腿中小肽的分離純化及表征.pdf

1、金華火腿作為我國典型的傳統(tǒng)干腌肉制品，享譽(yù)中外。隨著我國經(jīng)濟(jì)和生活水平的提高，消費(fèi)者對高質(zhì)量的干腌火腿需求也日益增加，但金華火腿落后的加工工藝已成為限制其發(fā)展的重要要素。要提高其在國內(nèi)外市場上的競爭力，就必須對其傳統(tǒng)工藝進(jìn)行改造，對其加工理論進(jìn)行深入細(xì)致的研究。本課題研究內(nèi)容是國家自然科學(xué)基金“氨肽酶在傳統(tǒng)干腌火腿加工過程中的作用機(jī)制研究”(30972129)中的一部分，目的是對火腿蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的小肽進(jìn)行分離純化和鑒定，對其分子量和氨

2、基酸序列進(jìn)行研究，了解蛋白質(zhì)的水解過程、水解規(guī)律和產(chǎn)物變化規(guī)律，為研究氨肽酶的作用提供依據(jù)。
　　 從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上，本研究內(nèi)容主要包含三個(gè)方面，一是對金華火腿曬腿結(jié)束、成熟中期和后熟結(jié)束時(shí)期中的蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物進(jìn)行提取并根據(jù)其分子量的大小進(jìn)行粗分；二是對提取的混合肽逐級進(jìn)行分離，得到分子量較小的組分；三是利用高效液相質(zhì)譜聯(lián)用儀對凝膠層析得到的肽進(jìn)一步分離并通過基質(zhì)輔助激光解析-三級四極桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行鑒定，利用質(zhì)譜自帶分析軟件分

3、析肽的分子量和氨基酸序列，并計(jì)算所得肽的相對峰面積，為評價(jià)酶在金華火腿加工過程中的作用提供依據(jù)。具體研究結(jié)果如下：
　　 (1)從金華火腿曬腿結(jié)束時(shí)期得到43種主要的小肽，分子量在204.1-1774.0 Da之間，共有13種二肽，9種三肽，6種四肽，2種五肽，2種六肽，1種七肽，2種八肽，1種十肽，2種十一肽，1種十三肽，2種十四肽和2種十五肽。Pro-Leu，Ala-His，Leu-Pro-Lys，Gly-Ser-Phe，A

4、la-Ala-Pro，Asp-His，Ser-Thr-Pro-Pro和Val-Glu在此時(shí)期相對峰面積較高，分別為16.19％，14.16％，9.83％，9.52％，8.99％，4.23％，3.97％和3.11％。由此可以看出此時(shí)期相關(guān)蛋白酶已經(jīng)發(fā)揮作用，將蛋白質(zhì)水解為小分子量肽。
　　 (2)成熟中期得到46種主要小肽，分子量在224.1-1390.4 Da之間，共有12種二肽，9種三肽，6種四肽，1種五肽，3種六肽，1種八肽

5、，3種十肽，4種十一肽，6種十二肽和1種十三肽。在此時(shí)期，Leu-Pro-Lys，Ala-His，Pro-Leu，Val-Ser-Pro-Leu，Leu-Ala-Ala-Pro，Ser-Gly-Leu，Pro-Pro-Gly-Gly，Ala-Ala-Pro，Val-Glu，Gly-Phe，Asp-His，Gly-Ser-Phe和Leu-Glu相對峰面積較高，分別為15.89％，8.17％，7.05％，6.98％，6.79％，5.54％，

6、4.7％，4.63％，4.53％，3.93％，3.83％，3.2％和3.19％。此時(shí)期分離的小肽相比曬腿結(jié)束，分量偏小，表明蛋白質(zhì)酶在火腿的成熟過程中繼續(xù)發(fā)揮作用，蛋白質(zhì)不斷發(fā)生水解作用，產(chǎn)生小肽。
　　 (3)成熟后期得到63種主要小肽，分子量在227.1-1540.8 Da之間，含有10種二肽，14種三肽，12種四肽，8種五肽，8種六肽，4種七肽，1種八肽，3種九肽，1種十肽，1種十二肽和1種十三肽。在這個(gè)時(shí)期內(nèi)，Leu-P

7、ro-Lys，Ser-Gly-Leu，Ala-Ala-Pro，Val-Glu，Pro-Leu，Ser-Gly-Val，Ala-His，Ala-Arg和Leu-His-Ala這九種肽重現(xiàn)性較好，相對峰面積也較高分別為10.49％，8.72％，7.36％，5.62％，3.83％，3.77％，3.4％，3.37％和3.03％。此時(shí)期得到的小肽最多，表明這一時(shí)期蛋白質(zhì)水解最嚴(yán)重，對火腿的特征品質(zhì)起著重要作用。
　　 (4)隨著加工時(shí)間的

8、延長，同一類肽的相對峰面積都出現(xiàn)了不同程度的變化，二肽在曬腿結(jié)束時(shí)期為49.57％，但在中期下降至39.94％，出現(xiàn)明顯的下降，后熟結(jié)束繼續(xù)下降至23.59％，整體下降幅度較大；三肽在曬退結(jié)束和成熟中期分別為35.36％和35.12％，變化不明顯，在后熟結(jié)束時(shí)期則出現(xiàn)較大幅度的上升為48.28％；四肽從曬腿結(jié)束的9.30％升至成熟中期的21.82％，出現(xiàn)一個(gè)強(qiáng)勁的上升過程，而后熟結(jié)束時(shí)期則為21.08％，相比成熟中期基本沒有什么變化；五

9、肽及其以上的肽在三個(gè)時(shí)期相對峰面積都較低，變化也不明顯。由此可以推測在金華火腿加工過程中，三肽基肽酶和二肽基肽酶對于三肽和二肽的產(chǎn)生發(fā)揮了重要的作用，而隨著加工時(shí)間的延長二肽出現(xiàn)較大幅度的降低，這也與以前報(bào)道的氨肽酶在這個(gè)過程中活性變化相一致，證明在成熟中期至后熟結(jié)束這個(gè)過程中氨肽酶對于二肽的降解以及游離氨基酸的產(chǎn)生起著關(guān)鍵性的作用，羧肽酶在這個(gè)過程可能也發(fā)揮了重要作用。
　　 (5)在得到的二肽、三肽和四肽中，已確認(rèn)Ser-G

10、lu、Val-Glu、Leu-Glu、Glu-Glu-Glu和Glu-Gly-Ser這5種肽呈現(xiàn)出鮮味，Pro-Leu和Leu-Lys呈苦味；Phe-Glu、Glu-Glu-Glu-Leu、Glu-Gly-Val和Glu-Val-Glu-Glu這四種肽在N端和c端都含有Glu也可能呈現(xiàn)鮮味；Ala-His、His-Pro、Val-Tyr、和Leu-His都是由一個(gè)疏水性和一個(gè)堿性氨基酸構(gòu)成也可能呈現(xiàn)出鮮味；Ser-Gly-Val、Gly