NMMO直接溶解法制備纖維素微球介質(zhì)及疏水性電荷誘導(dǎo)層析應(yīng)用.pdf

1、從復(fù)雜料液中分離單一種類蛋白是一項(xiàng)非常艱巨的任務(wù)，需要經(jīng)過(guò)一系列分離純化步驟才能實(shí)現(xiàn)。與傳統(tǒng)的化學(xué)產(chǎn)品的分離純化相比，蛋白質(zhì)純化擁有明顯的不同。首先，蛋白質(zhì)對(duì)于外部條件非常敏感，劇烈的變化會(huì)造成蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的破壞，因此要求蛋白質(zhì)純化過(guò)程溫和可控。其次，目標(biāo)蛋白所在的培養(yǎng)液中的含量通常較低，而且存在大量的雜質(zhì)成分，這給蛋白質(zhì)純化造成了較大困難，收率低、成本高，因此選擇合適的蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)具有重要意義。
　　在各種蛋白質(zhì)分離純化

2、方法中，層析技術(shù)是最重要的一類，該技術(shù)始于1906年Mikhail Tswett的發(fā)現(xiàn)。根據(jù)操作模式的不同，層析技術(shù)可以分為固定床、流化床以及擴(kuò)張床。固定床是最為傳統(tǒng)的層析操作模式，技術(shù)成熟，分辨率高，但是含有顆粒的料液會(huì)導(dǎo)致固定床床層堵塞，因此進(jìn)入固定床的料液需進(jìn)行前處理。流化床則可以直接處理含有顆粒的料液，但是流化床中溝流，返混現(xiàn)象嚴(yán)重，導(dǎo)致流化床分離效率較差，回收率低。擴(kuò)張床是一種新型的層析操作模式，和流化床一樣，可以實(shí)現(xiàn)從含有顆

3、粒的料液中直接分離目標(biāo)蛋白，擴(kuò)張床床層與固定床相似，保持了相對(duì)穩(wěn)定，因而保持了較高的分辨率和較好的分離效果。擴(kuò)張床結(jié)合了固定床和流化床的優(yōu)勢(shì)，將固液分離、初步純化以及蛋白濃縮集成為一個(gè)單元，是一項(xiàng)非常有潛力的新型集成化層析技術(shù)。
　　擴(kuò)張床的基本操作流程如下：首先，平衡緩沖液從床層底部以一定流速通入，在自下而上的液流作用下，具有一定的粒徑與密度分布的介質(zhì)向床柱上部移動(dòng)，床層發(fā)生膨脹。當(dāng)重力、阻力、拖曳力等作用力達(dá)到平衡時(shí)，不同粒徑

4、和密度的介質(zhì)顆粒停止運(yùn)動(dòng)，停留在床層不同高度在床柱中形成穩(wěn)定的床層分布。當(dāng)床層穩(wěn)定膨脹并完成平衡后，切換通入料液，料液中的顆粒物質(zhì)，如細(xì)胞或細(xì)胞碎片等，可以通過(guò)顆粒之間存在空隙，而不堵塞床層，目標(biāo)蛋白則被介質(zhì)顆粒吸附。然后切換回平衡溶液，對(duì)床層進(jìn)行沖洗，將未吸附的蛋白與雜質(zhì)沖走。之后以洗脫液洗脫介質(zhì)吸附的目標(biāo)蛋白。完成洗脫后對(duì)床層進(jìn)行再生和沖平衡，進(jìn)入下一循環(huán)。由此可見，特殊設(shè)計(jì)的介質(zhì)是實(shí)現(xiàn)擴(kuò)張床運(yùn)行的基礎(chǔ)，決定了擴(kuò)張床的吸附性能和分離

5、效率。在用于制備擴(kuò)張床介質(zhì)的各類材料中，纖維素是一種優(yōu)秀的備選對(duì)象。但是傳統(tǒng)的纖維素介質(zhì)主要通過(guò)纖維素黃酸酯方法來(lái)制備，反應(yīng)條件苛刻，過(guò)程難以控制，且需要昂貴的試劑，一些副產(chǎn)物對(duì)環(huán)境有害。因此，本論文采用了N-甲基氧化嗎啉(N-methyl morpholineoxide，NMMO)作為非衍生化“綠色”溶劑，直接溶解纖維素，并添加碳化鎢作為增重劑，制備成纖維素-碳化鎢復(fù)合微球基質(zhì)。
　　在吸附模式的選擇上，本文選擇了疏水性電荷誘導(dǎo)

6、層析(Hydrophobic charge-induction chromatography，HCIC)。HCIC是一種新型的層析技術(shù)，與其他傳統(tǒng)的層析技術(shù)相比，HCIC擁有以下優(yōu)勢(shì):其一、HCIC介質(zhì)具有較好的耐鹽吸附能力，可以在較寬的鹽濃度范圍沒保存良好的吸附性能，因此無(wú)需對(duì)料液進(jìn)行加鹽后稀釋操作，節(jié)省前處理過(guò)程;其二、洗脫條件較為溫和，減少了抗體變性或聚集的情況;其三、HCIC介質(zhì)性質(zhì)穩(wěn)定，可以承受較為苛刻的再生條件;其四、HCI

7、C配基結(jié)合牢固，不會(huì)污染目標(biāo)產(chǎn)物。因此，本文選擇HCIC配基2-巰基咪唑(2-mercaptoimidazole，MI)偶聯(lián)到纖維素基質(zhì)上，制成疏水性電荷誘導(dǎo)層析介質(zhì)，考察了新介質(zhì)的蛋白吸附性能，并應(yīng)用于免疫球蛋白G(IgG)的分離純化。
　　具體研究?jī)?nèi)容如下：
　　(1)纖維素是地球上最為豐富的聚合物，是植物細(xì)胞重要的組成成分。纖維素是由葡萄糖組成的線性多聚體，含有大量氫鍵，是制備多孔顆?；|(zhì)的潛在材料。但是大量氫鍵的存在

8、導(dǎo)致纖維素形態(tài)穩(wěn)定，為了更好地利用纖維素進(jìn)行制備，首先要對(duì)纖維素進(jìn)行溶解。但是傳統(tǒng)的溶解方法，比如纖維素黃酸酯方法，存在諸如成本過(guò)高或環(huán)境污染等不足。NMMO是一種無(wú)毒的、環(huán)狀、脂肪族叔胺氧化物，常被用作有機(jī)合成中的氧化物。因?yàn)镹-O的存在，NMMO擁有高度的極性，可溶于水，并形成氫鍵?；谶@些特性，NMMO被研究者用于溶解纖維素，取得了良好的效果。
　　本文使用NMMO作為溶劑，配合反相懸浮法制備纖維素-碳化鎢復(fù)合微球，具體過(guò)程

9、見圖1。
　　具體制備方法如下：使用NMMO作為非衍生化溶劑，在高溫條件下直接溶解纖維素，加入碳化鎢作為增重劑，充分?jǐn)嚢杌靹?。為了防止與外界空氣進(jìn)行水分交換，整個(gè)反應(yīng)體系置于干燥氮?dú)猸h(huán)境下，同時(shí)加入抗氧化劑防止NMMO的降解。之后將纖維素-碳化鎢懸浮液轉(zhuǎn)入水相中，繼續(xù)攪拌，同時(shí)降低溫度，使纖維素結(jié)晶成球。在制備過(guò)程中，研究了纖維素溶解溫度和時(shí)間、纖維素/NMMO/水混合溶液中的水含量、纖維素濃度、分散體系以及冷卻過(guò)程對(duì)制備纖維素微

10、球的影響。結(jié)果顯示，纖維素的溶解度隨著溫度的提高以及時(shí)間的增加而增加，對(duì)于4 wt％纖維素溶液，105～110℃、反應(yīng)30 min較為合適，進(jìn)一步提升溫度，則會(huì)造成NMMO的降解，不利于纖維素溶解。含水量對(duì)纖維素/NMMO/水混合溶液形成均一溶液非常重要，研究發(fā)現(xiàn)11～15 wt％的含水量較為適宜，低于11 wt％或高于15 wt％，都會(huì)導(dǎo)致難以成球。纖維素濃度影響結(jié)果顯示，隨著纖維素濃度加大，溶解時(shí)間延長(zhǎng)，而且由于黏度過(guò)大，同樣會(huì)導(dǎo)致

11、難以成球。在分散體系控制中，油相與纖維素溶液的比例，分散劑的選擇以及攪拌速度是三個(gè)重要影響因素。當(dāng)轉(zhuǎn)速過(guò)大或油相過(guò)少是，纖維素液滴的碰撞機(jī)率加大，不利于成球。對(duì)于冷卻過(guò)程控制的研究發(fā)現(xiàn)，NMMO在該過(guò)程中起主導(dǎo)作用。綜合以上研究，確定了最終優(yōu)化操作條件為:105℃，30 min進(jìn)行溶解反應(yīng);纖維素/NMMO/水混合溶液的含水量為11～15 wt％;纖維素濃度為4％ w/w;分散體系油相比例為3～6，轉(zhuǎn)速700～1000rpm，分散劑使用

12、4％ w/w Tween80;冷卻過(guò)程為每20 min下降5℃，下降范圍為105℃至10℃。按照此條件，最終制得了具有良好的球形度、合適粒徑分布的復(fù)合微球，經(jīng)篩分得到了粒徑較大的Cell-TuC-N-L微球和粒徑較小的Cell-TuC-N-S微球，濕真密度約1.6～1.7g/mL，含水率48～53％，孔隙率80～90％，孔容分別為1.05～1.13mL/g(Cell-TuC-N-L)和0.92～1.08 ml/g Cell-TuC-N-

13、S），孔道半徑為72～91nm，比表面積為17.64～23.25 m2/mL。與傳統(tǒng)的纖維素黃酸酯化法相比，本論文所采用的NMMO直接溶解纖維素新方法具有更好的環(huán)境友好性，可以節(jié)省制備時(shí)間，顯示出規(guī)模化制備的應(yīng)用潛力。
　　(2)擴(kuò)張床作為一種新型的生物分離技術(shù)，穩(wěn)定的膨脹床層對(duì)該技術(shù)的吸附性能和分離效率有重要影響。因此考察制備的新介質(zhì)在擴(kuò)張床中的膨脹性能以及床層擴(kuò)散程度對(duì)評(píng)價(jià)該介質(zhì)是否適合作為擴(kuò)張床介質(zhì)是必要的。衡量床層擴(kuò)散程度

14、的參數(shù)主要包括:理論塔板數(shù)(N)、理論塔板高度(HETP)、Bo準(zhǔn)數(shù)，和軸向擴(kuò)散系數(shù)。前兩者來(lái)源于與流化床相似的理論塔板數(shù)模型，后兩者來(lái)源于軸向擴(kuò)散模型。4個(gè)參數(shù)都基于停留時(shí)間分布(RTD)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果計(jì)算獲得。N和HETP對(duì)床層軸向擴(kuò)散的描述簡(jiǎn)單直觀，N越大，HETP越小，床層軸向擴(kuò)散程度越小;對(duì)于Bo準(zhǔn)數(shù)而言，一般認(rèn)為當(dāng)Bo大于40時(shí)，可以認(rèn)為液相近似為平推流，軸向擴(kuò)散程度低。而對(duì)于Dax而言，當(dāng)數(shù)值位于10-5 m2/s水平或以下時(shí)

15、，可以認(rèn)為床層穩(wěn)定，軸向擴(kuò)散程度低。通過(guò)4個(gè)參數(shù)的測(cè)定，可以獲得擴(kuò)張床床層軸向擴(kuò)散程度較為準(zhǔn)確的認(rèn)識(shí)，評(píng)價(jià)介質(zhì)用于擴(kuò)張床操作的潛力。
　　對(duì)于本文制備的纖維素-碳化鎢復(fù)合微球Cell-TuC-N-S，膨脹特性結(jié)果顯示，Cell-TuC-N-S具有良好的膨脹性能，膨脹率隨著流速增加而增加。在膨脹率2～3范圍內(nèi)，操作流速可高達(dá)1100～1800 cm/h，與常見的商業(yè)化擴(kuò)張床吸附基質(zhì)Streamline系列（200～400 cm/h）

16、和Streamline Direct（400～800 cm/h）相比，在提高操作流速上具有顯著的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)測(cè)定了軸向擴(kuò)散性能，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著流速增加，理論塔板數(shù)和理論塔板高度分別發(fā)生一定程度的下降與上升，說(shuō)明流速提升會(huì)增加軸向擴(kuò)散程度。Bo準(zhǔn)數(shù)的測(cè)定顯示，隨著流速上升，Bo準(zhǔn)數(shù)僅從127下降到94，明顯高于床層穩(wěn)定的40;而各流速條件下，軸向擴(kuò)散系數(shù)Dax數(shù)值維持在10-5 m2/s水平，說(shuō)明Cell-TuC-N-S擴(kuò)張床在總體上處

17、于穩(wěn)定狀態(tài)，其軸向擴(kuò)散程度較低，適合用于高流速條件的擴(kuò)張床操作。
　　(3)抗體作為重要的生物產(chǎn)品，已經(jīng)成為的分離純化技術(shù)的典型對(duì)象。目前用于抗體分離純化的手段主要為Protein A親和層析。該技術(shù)擁有出色的選擇特異性，可以實(shí)現(xiàn)抗體高效高純度的分離純化。但Protein A親和層析也有其不足之處，比如高昂的成本，苛刻的洗脫條件等。為此，近年來(lái)研究者開發(fā)了多種新型的分離技術(shù)，希望能夠改善和彌補(bǔ)Protein A親和層析的不足。疏水

18、性電荷誘導(dǎo)層析(HCIC)就是一種新型的層析技術(shù)，它的配基可以將多種作用力結(jié)合在一起（通常為疏水作用和靜電作用），其吸附作用呈現(xiàn)pH依賴性。即在中性條件下，HCIC的配基不帶電荷，以疏水作用吸附目標(biāo)蛋白;在酸性條件下，HCIC的配基和目標(biāo)蛋白帶有相同電荷，從而產(chǎn)生靜電排斥力，解吸蛋白。因?yàn)楠?dú)特的吸附原理，HCIC成為一種非常有潛力的抗體分離技術(shù)。
　　本文采用二乙烯砜活化了制備得到的Cell-TuC-N-S基質(zhì)，偶聯(lián)上了新型的HC

19、IC配基2-巰基咪唑(MI)，制備成具有疏水性電荷誘導(dǎo)層析基團(tuán)的Cell-TuC-N-S-DVS-MI介質(zhì)，并考察抗體IgG在該介質(zhì)上的吸附行為。制備原理如圖2所示。
　　首先對(duì)制備的活化過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化，考察了二乙烯砜用量、pH和反應(yīng)時(shí)間對(duì)活化過(guò)程的影響。在考察二乙烯砜用量影響時(shí)表明，隨著用量增加，基質(zhì)活化密度上升，在用量比例達(dá)到0.6～0.8后，活化密度趨于穩(wěn)定;在研究pH對(duì)活化的影響發(fā)現(xiàn)，活化密度在pH11時(shí)到達(dá)最大值;而反應(yīng)時(shí)

20、間影響結(jié)果顯示，在反應(yīng)進(jìn)行3h后，基質(zhì)活化密度不再上升，說(shuō)明此時(shí)反應(yīng)趨于飽和。綜上考察結(jié)果，確定了活化反應(yīng)條件為二乙烯砜用量比例1.0，pH11，反應(yīng)時(shí)間4h，由此獲得了Cell-TuC-N-S-DVS的活化密度為100μmol/mL的基質(zhì)。在對(duì)該基質(zhì)活化的基礎(chǔ)上，偶聯(lián)上配基MI。本文以3倍于活化基團(tuán)的MI的摩爾比例用量進(jìn)行反應(yīng)，偶聯(lián)上所要的配基MI，制得的Cell-TuC-N-S-DVS-MI的配基密度為60μmol/mL介質(zhì)。采用新

21、制備的Cell-TuC-N-S-DVS-MI進(jìn)行了抗體吸附試驗(yàn)，以IgG為模型蛋白，測(cè)定了其靜態(tài)吸附平衡數(shù)據(jù)，考察了新介質(zhì)的蛋白吸附行為。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IgG吸附受pH影響顯著，合適吸附pH值為7.0和8.0，飽和吸附容量Qm分別達(dá)到77.68和78.02 mg/mL介質(zhì);當(dāng)pH下降至4.0時(shí)，IgG吸附容量顯著下降。分析了pH值影響的主要原因，當(dāng)pH處于IgG的等電點(diǎn)和配基的pKa以下時(shí)，IgG和配基之間存在靜電排斥作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的解吸

22、，符合HCIC的典型特征。
　　(4)IgG是一種分子量為150 kDa左右的大生物分子，pI值為6～8左右，包含兩條重鏈與兩條輕鏈，分別為50 kDa和25 kDa。IgG是免疫系統(tǒng)中最重要的一類抗體，廣泛存在于血清和組織液中，有超過(guò)一半的抗體屬于IgG。因此，IgG產(chǎn)品擁有非常高的應(yīng)用和研究?jī)r(jià)值。如果采用傳統(tǒng)的沉淀或過(guò)濾方法分離IgG，獲得的IgG純度較低，活性也較差，限制了IgG的應(yīng)用。而在Protein A親和層析分離Ig

23、G時(shí)，需要采用過(guò)酸的溶液進(jìn)行洗脫，容易破壞IgG的活性。而文獻(xiàn)以及我們實(shí)驗(yàn)室前期的研究表明，HCIC層析是一項(xiàng)非常有潛力的抗體分離手段，如商業(yè)化HCIC介質(zhì)MEP HyperCel已經(jīng)成功應(yīng)用于抗體的分離。本文中制備的新型HCIC介質(zhì)Cell-TuC-N-S-DVS-MI也顯示了對(duì)IgG分離的潛力。
　　為了證明新型介質(zhì)Cell-TuC-N-S-DVS-MI分離抗體的可行性，以豬血漿中IgG作為分離對(duì)象，基于前期靜態(tài)平衡吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)

24、果，采用固定床層析進(jìn)行分離。血漿料液以pH7.0上樣，在酸性條件下進(jìn)行洗脫，考察了洗脫液pH的影響，pH的范圍為4.0、3.6、3.4和3.0，同時(shí)比較了用硫酸銨進(jìn)行前處理后對(duì)分離效果的影響。結(jié)果顯示，大部分雜質(zhì)可在穿透階段流出，采用pH4.0～3.0條件下洗脫，IgG純度可達(dá)80％以上，pH3.6洗脫可獲得最大純度為89.4％，純化因子為3.35。其層析結(jié)果和電泳結(jié)果見圖3。用硫酸銨對(duì)原料進(jìn)行前處理后，可以顯著提升IgG的回收純度。其

25、主要原因在于，高鹽濃度會(huì)破壞蛋白質(zhì)的表面水化層，增強(qiáng)了配基與IgG之間的疏水作用。以上結(jié)果表明，以MI為功能配基的新型HCIC介質(zhì)可以從復(fù)雜的血漿料液中高效分離IgG，具有潛在的應(yīng)用前景。
　　本文還嘗試了將介質(zhì)Cell-TuC-N-S-DVS-MI用于擴(kuò)張床吸附分離血漿料液中IgG。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，所制備的介質(zhì)比較容易發(fā)生破碎，導(dǎo)致碳化鎢泄漏。這一現(xiàn)象的原因分析認(rèn)為，一是操作流速過(guò)高，二是介質(zhì)的機(jī)械強(qiáng)度不足。介質(zhì)機(jī)械強(qiáng)度發(fā)生下降可能

26、是由于活化與偶聯(lián)過(guò)程導(dǎo)致纖維素基質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。
　　總之，本論文圍繞新型纖維素復(fù)合基質(zhì)的制備、功能化以及蛋白分離應(yīng)用，展開了系統(tǒng)研究，獲得了一些有價(jià)值的結(jié)果，為新型介質(zhì)開發(fā)和抗體分離純化提供一定的指導(dǎo)。
　　基于本文工作，后續(xù)可以從以下幾個(gè)方面進(jìn)行進(jìn)一步的研究:
　　(1)雖然NMMO是一類非衍生溶劑，具有良好的環(huán)境友好特性，但是在本文研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，NMMO可能造成纖維素氧化以及結(jié)構(gòu)改變，不利于基質(zhì)后期偶聯(lián)配基反應(yīng)

27、。所以需要進(jìn)一步尋找其他更合適的溶劑，用于溶解纖維素。
　　(2)對(duì)于纖維素球的制備而言，冷卻過(guò)程的控制非常重要。本文中考察并優(yōu)化的制備條件仍然有限，需要對(duì)更多的溶劑和再生方法進(jìn)行嘗試，從而進(jìn)一步改善纖維素球的制備過(guò)程。
　　(3)SDS-PAGE結(jié)果顯示IgG的洗脫峰中仍然殘留一定數(shù)量的白蛋白與纖維蛋白原，影響了IgG的純度，所以有必要進(jìn)一步改進(jìn)IgG的分離純化過(guò)程?？梢酝ㄟ^(guò)增加膜過(guò)濾等前處理手段進(jìn)行改善。
　　(4