HOG1抑制劑和環(huán)境因子對球頭三型孢菌產(chǎn)多元醇的影響.pdf

1、赤蘚糖醇作為一種新型的食品甜味劑，甜度約為蔗糖的60％-70％，具備熱值低、不影響人體血糖水平和抗齲齒等優(yōu)良特性，因而市場前景十分廣闊。球頭三型孢菌利用葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)赤蘚糖醇的過程中，往往伴隨著甘油副產(chǎn)物的產(chǎn)生，這既增大了后期赤蘚糖醇的分離純化難度，又降低了赤蘚糖醇的得率。因此，采用合適的調(diào)控策略對球頭三型孢菌發(fā)酵過程進(jìn)行調(diào)控，降低副產(chǎn)物產(chǎn)量，這對于赤蘚糖醇的放大化生產(chǎn)尤為重要。因此，針對球頭三型孢菌產(chǎn)多元醇的發(fā)酵過程調(diào)控，本文主要圍繞

2、高滲透壓甘油途徑(High Osmolarity Glycerol Pathway，HOG)抑制劑添加、環(huán)境滲透壓調(diào)節(jié)以及環(huán)境酸堿度調(diào)節(jié)等三個方面開展研究，主要研究結(jié)果如下:
　　基于HOG1可激活與甘油合成相關(guān)酶的基因，研究首先探索了PD169316、SB239063、SB242235、SB202190和SB203580等五種HOG1抑制劑對球頭三型孢菌發(fā)酵產(chǎn)多元醇的影響。發(fā)現(xiàn)SB239063、SB202190和SB203580

3、對赤蘚糖醇合成的促進(jìn)作用從強(qiáng)到弱依次為:SB239063、SB202190和SB203580。而添加PD169316和SB242235反而降低了赤蘚糖醇的產(chǎn)量。對SB239063、SB202190和SB203580三種抑制劑的作用效果進(jìn)一步研究后發(fā)現(xiàn)，SB239063對于降低甘油副產(chǎn)物產(chǎn)量提高赤蘚糖醇得率的效果最好。SB239063的添加使發(fā)酵48 h的球頭三型孢菌細(xì)胞中胞漿3-磷酸甘油脫氫酶(ctGPD)的酶活降低了19.06％，使發(fā)

4、酵72 h的赤蘚糖還原酶(ER)酶活提高了33.20％。其次，Western blot分析結(jié)果還顯示，SB239063抑制了HOG1的脫磷酸化，降低了HOG1的激酶活性。最后，通過添加10μMSB239063到發(fā)酵培養(yǎng)基中，經(jīng)過120 h的發(fā)酵，其產(chǎn)物中甘油產(chǎn)量比對照組降低了20.57％，赤蘚糖醇產(chǎn)量提高了31.16％。
　　另一方面，本文研究采用添加無機(jī)鹽(NaCl和KCl)的方式來探索環(huán)境滲透壓對球頭三型孢菌產(chǎn)多元醇的調(diào)控。研

5、究結(jié)果表明，相同質(zhì)量濃度下，KCl對赤蘚糖醇產(chǎn)量的提升作用優(yōu)于NaCl，且添加5g/L KCl時，赤蘚糖醇產(chǎn)量比對照組提高了44.21％。進(jìn)一步的發(fā)酵對比實驗表明，5g/L KCl的添加提高了發(fā)酵后期(84h-120 h)球頭三型孢菌細(xì)胞內(nèi)ER的活力，發(fā)酵96h時，其酶活為對照組的2.80倍，同時也增大了細(xì)胞對葡萄糖的利用速率，發(fā)酵120h后，殘?zhí)橇績H為0.50g/L，而對照組的殘?zhí)侨愿哌_(dá)21.50g/L。在5-L發(fā)酵罐中進(jìn)行放大，發(fā)酵

6、120h后，赤蘚糖醇產(chǎn)量達(dá)到50.54g/L，比對照組提高了47.69％，而最終的甘油產(chǎn)量只比對照組提高了9.59％。
　　最后，針對球頭三型孢菌在發(fā)酵前期產(chǎn)生大量有機(jī)酸，對細(xì)胞造成低pH脅迫的問題，在5-L發(fā)酵罐中進(jìn)行pH控制策略的優(yōu)化研究。通過對恒定pH(4.5、5.0、5.5和6.0）發(fā)酵的結(jié)果測定及分析，發(fā)現(xiàn)pH5.0最適合球頭三型孢菌進(jìn)行細(xì)胞生長，pH6.0則最有利于赤蘚糖醇合成。因此在單一pH控制的基礎(chǔ)上，本文研究提出

7、兩階段pH控制策略，即:在發(fā)酵前期(0-36 h)控制pH5.0，之后控制pH6.0。研究結(jié)果表明:在兩階段pH調(diào)控發(fā)酵時，球頭三型孢菌的最大細(xì)胞活力比單一控制pH策略的最大細(xì)胞活力提高了73.74％，最大ER酶活比單一控制pH策略的最大酶活提高了44.74％，且在發(fā)酵120 h后，甘油產(chǎn)量為21.19g/L，與單一pH控制策略中的最低甘油產(chǎn)量(pH5.0，21.18g/L)持平，而赤蘚糖醇的產(chǎn)量高達(dá)56.78g/L，比單一控制pH的最