HOG1缺失型球頭三型孢菌的構(gòu)建及其發(fā)酵調(diào)控研究.pdf

1、球頭三型孢菌（Trichosporonoides oedocephalis）在發(fā)酵中產(chǎn)生多種多元醇，如赤蘚糖醇，核糖醇和甘油等。赤蘚糖醇作為低熱值糖類是國際認(rèn)可的食品添加劑，而核糖醇則是重要的抗病毒藥物中間體。甘油作為赤蘚糖醇生產(chǎn)中的副產(chǎn)物，它的存在不僅限制了赤蘚糖醇收率的提高，也為后續(xù)分離提純帶來困難。HOG1基因能夠激活與甘油合成相關(guān)酶的基因。HOG1信號途徑的中心信號級聯(lián)系統(tǒng)由MAP激酶（Mitogen-activated pro

2、tein kinases，MAPK）組成，并在高滲透壓下調(diào)節(jié)多元醇的生產(chǎn)。
　　本文從分子水平和發(fā)酵水平的角度對球頭三型孢菌發(fā)酵產(chǎn)多元醇開展研究，主要研究內(nèi)容包括：合理設(shè)計(jì)敲除組件；對球頭三型孢菌HOG1基因進(jìn)行敲除；對工程菌發(fā)酵水平進(jìn)行調(diào)控。首先，針對酵母菌外源基因轉(zhuǎn)化率較低的問題，在基因敲除過程中研究了一種新型的化學(xué)轉(zhuǎn)化方法，此方法將細(xì)胞壁消化酶與傳統(tǒng)的醋酸鋰轉(zhuǎn)化法相結(jié)合。研究了zymolyase-100酶濃度、消化時間、醋酸

3、鋰、氯化鈣以及氯化鋰等五個單因素對球頭三型孢菌轉(zhuǎn)化率的影響。并根據(jù)單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析。找出一種更加適合球頭三型孢菌的外源基因?qū)敕?，即：酶濃度?0.17μg/mL,孵化時間為40.04 min, CaCl2濃度在99.05μL/mL，在此基礎(chǔ)上使得球頭三型孢菌轉(zhuǎn)化率提高到44.3％。該步驟為HOG1基因的成功敲除奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。其次，實(shí)驗(yàn)從原始球頭三型孢菌出發(fā)，以擴(kuò)增出的球頭三型孢菌HOG1基因和pUG6序列設(shè)計(jì)敲除組件，結(jié)合C

4、re／LoxP系統(tǒng)基因敲除法，對球頭三型孢菌HOG1基因進(jìn)行敲除。并在基因敲除完成后進(jìn)行六次傳代培養(yǎng)，構(gòu)建了穩(wěn)定遺傳的HOG1缺失型基因工程菌。最后，本實(shí)驗(yàn)又將原始菌與工程菌進(jìn)行發(fā)酵研究，先后研究了檸檬酸濃度對原始菌與工程菌的影響，當(dāng)檸檬酸濃度0.3%時工程菌赤蘚糖醇產(chǎn)量最大為69.12g/L。其單因素分別設(shè)置為：葡萄糖濃度為20%，氯化鈉濃度為0.75g/L，轉(zhuǎn)速設(shè)置為200r/min，酵母粉濃度設(shè)置為1.0%，控制硫酸鎂濃度為0.7