時空分辨散射相關(guān)光譜新方法研究及其生物應(yīng)用.pdf

1、分子是保持物質(zhì)化學(xué)性質(zhì)的最小單元，從單分子的水平上活體、原位、實時地研究物質(zhì)之間的相互作用是人類在探索生命奧秘的過程中一直孜孜以求的夢想。近年來，不斷發(fā)展的單分子光學(xué)技術(shù)正在促使這一夢想轉(zhuǎn)變?yōu)楝F(xiàn)實，熒光相關(guān)光譜（Fluorescence Correlation Spectroscopy，F(xiàn)CS）正是這類技術(shù)的一個典型代表。熒光相關(guān)光譜通過顯微共焦技術(shù)構(gòu)建一個極小的檢測微區(qū)（通常小于10-15L），熒光分子或粒子由于布朗運動或化學(xué)反應(yīng)等動

2、力學(xué)過程而不斷進出該微區(qū)，引起微區(qū)內(nèi)熒光信號的漲落即熒光強度隨著時間而變化。高靈敏度的檢測器以極高的時間分辨率捕獲不斷漲落的信號，這些信號經(jīng)過自相關(guān)或互相關(guān)分析，就能解析出單分子或單粒子的動力學(xué)信息。作為單分子光學(xué)技術(shù)的先驅(qū)，熒光相關(guān)光譜自上個世紀七十年代誕生以來，憑借其極高的靈敏度和時間分辨率以及良好的統(tǒng)計可靠性，目前已成為研究單個熒光分子動力學(xué)行為的常規(guī)方法，在大分子構(gòu)象、信號識別、生化反應(yīng)動力學(xué)等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。

3、r>　　但是，熒光相關(guān)光譜也面臨著自身的限制和新的挑戰(zhàn)。一是傳統(tǒng)的熒光探針，包括有機熒光染料、熒光蛋白、量子點等，在強光或長時間照射下均存在熒光衰減甚至漂白的現(xiàn)象，此外，量子點還存在熒光閃爍。探針自身熒光強度的變化與動力學(xué)過程引起的強度變化疊加在一起，嚴重干擾檢測的準(zhǔn)確性。熒光強度不斷衰減的探針也無法滿足生物體系內(nèi)的長時間實時監(jiān)測的要求。二是生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的迅速發(fā)展給分析科學(xué)帶來了新的挑戰(zhàn)，復(fù)雜、不均勻的生物體系要求高通量、多通道的并

4、行檢測手段。目前的熒光相關(guān)光譜技術(shù)采用共聚焦光學(xué)構(gòu)型，光電倍增管或雪崩二極管（Avalanche Diode，APD）是最常用的檢測器，所以只能進行單窗口檢測，無法針對不均勻體系實現(xiàn)高通量、多通道的并行檢測。
　　本論文從以上兩個科學(xué)問題出發(fā)，選擇金屬納米粒子替代傳統(tǒng)的熒光分子作為光學(xué)探針，創(chuàng)造性地引入全內(nèi)反射（Total Internal Reflection，TIR）、暗場（Dark field）等光學(xué)構(gòu)型，使用高靈敏度的電子

5、倍增電荷耦合器件（Electron Multiplying Charge-Coupled Device，EMCCD）作為檢測器，建立新型波動相關(guān)光譜方法，將波動相關(guān)光譜擴展至更廣的領(lǐng)域，解決以上兩個問題。主要研究工作包括以下幾個方面：
　　（1）建立基于全內(nèi)反射構(gòu)型的時空分辨散射相關(guān)光譜（Spatially Resolved Scattering Correlation Spectroscopy，SRSCS）。首先，我們合成了化學(xué)

6、性質(zhì)穩(wěn)定、尺寸均勻的銀納米粒子，采用其強烈的散射光作為檢測信號。在全內(nèi)反射熒光顯微鏡平臺上，通過使用自制的毫米級小孔替換原系統(tǒng)的發(fā)射濾光片，將銀納米粒子的散射光與激發(fā)光及其反射光進行有效分離，同時采用電子倍增電荷耦合器件作為檢測器實現(xiàn)陣列檢測。利用這種新型的波動相關(guān)光譜方法，我們對粒徑為16±2 nm的銀納米粒子進行了動力學(xué)行為研究，新方法對納米粒子濃度和擴散系數(shù)的變化均有靈敏的響應(yīng)，線性相關(guān)系數(shù)分別為0.998和0.988，檢測信噪比

7、高達14.4。實驗表明，這種新方法能高靈敏、高通量、多通道地檢測納米粒子的濃度、擴散速度等動力學(xué)信息。此外，我們還研究了不同實驗條件對檢測結(jié)果的影響，證明采樣200000次的檢測結(jié)果具有可靠的統(tǒng)計精度。
　?。?）建立基于暗場激發(fā)構(gòu)型的時空分辨散射相關(guān)光譜（Tempo-Spatially Resolved Scattering Correlation Spectroscopyunder Dark-Field Illuminatio

8、n，DFSCS）。暗場顯微鏡是一種簡單易用、價格低廉的光學(xué)顯微鏡，只需在常用的明場顯微鏡上裝配一個暗場聚光鏡即可實現(xiàn)。我們首次在暗場顯微構(gòu)型上建立了波動相關(guān)光譜檢測方法。作為波動相關(guān)光譜家族中一種全新的光學(xué)構(gòu)型，我們首先推導(dǎo)了DFSCS的理論模型，并提出了評價該系統(tǒng)統(tǒng)計精度的方法。然后我們通過計算機模擬和實驗結(jié)果驗證了模型的適應(yīng)性和可靠性。蒙特卡洛模擬（Monte Carlo simulation）得到的粒子濃度和擴散系數(shù)與設(shè)定值的差別

9、小于4％。我們還從理論和實驗兩個角度分別研究了新系統(tǒng)的靈敏度，證實DFSCS能準(zhǔn)確檢測納米粒子濃度和擴散系數(shù)的變化，線性相關(guān)系數(shù)分別為0.972和0.993，檢測信噪比高達17.6。針對金納米粒子的實際檢測結(jié)果表明該系統(tǒng)對納米粒子的濃度、擴散系數(shù)等動力學(xué)參數(shù)有靈敏的響應(yīng)。DFSCS的時間分辨率提高到0.5 ms每幀，單次檢測的采樣次數(shù)達到500000次，統(tǒng)計精度更高。
　?。?）將時空分辨散射相關(guān)光譜應(yīng)用于研究細胞內(nèi)納米粒子的動力

10、學(xué)行為。我們利用癌癥治療藥物赫賽?。℉erceptin）對直徑16 nm的金納米粒子進行修飾，通過赫賽汀的介導(dǎo)作用將金納米粒子轉(zhuǎn)運至人子宮頸癌 SiHa細胞內(nèi)。這些納米粒子特征性的分布在細胞膜或不同的細胞器中。在暗場顯微鏡下，細胞內(nèi)的金納米粒子散發(fā)出強烈的散射信號。我們利用時空分辨散射相關(guān)光譜系統(tǒng)收集這些信號，研究納米粒子在細胞內(nèi)不同區(qū)域的動力學(xué)行為和細胞內(nèi)環(huán)境的不均勻性。納米粒子的擴散系數(shù)分布在0.056μm2/s至0.235μm2/