納米金共振散射相關(guān)光譜及其應(yīng)用.pdf

1、熒光相關(guān)光譜是一種高靈敏的單分子探測方法,被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)及其相關(guān)的領(lǐng)域,特別是在核酸雜交檢測,基因表達(dá)分析,生物分子的相互作用及細(xì)胞內(nèi)的一些生物化學(xué)過程的研究中發(fā)揮著其它方法無可替代的作用。由于大多數(shù)化合物特別是生物分子本身沒有熒光(或熒光很弱),用熒光方法(如熒光相關(guān)光譜)研究這些化合物時通常需要用熒光染料或熒光量子點進(jìn)行標(biāo)記。然而,有機(jī)熒光染料的化學(xué)穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性較差,在某些生物應(yīng)用中受到一定的限制。另外,目前制備的熒光量子

2、點大都由Cd,Pb,Hg,Te,Se等有毒元素組成,不能用于生物體內(nèi)的檢測。
　　 金納米粒子由于其表面效應(yīng)、體積效應(yīng)和量子尺寸效應(yīng)表現(xiàn)出特殊的光學(xué)性質(zhì),如強(qiáng)的散射特性和吸收特性。另外金納米粒子生物相容性好、易于與生物分子連接的特性,是一種具有廣泛應(yīng)用前景的生物探針。目前金納米探針已成功地應(yīng)用于核酸雜交檢測,免疫分析以及細(xì)胞成像等領(lǐng)域?，F(xiàn)有的檢測方法主要有:比色法、紫外光譜法、散射法和動態(tài)光散射法,這些方法都有自己的優(yōu)缺點。主要

3、的缺點在于檢測的靈敏度不高,而且都是集合的方法。本論文基于熒光相關(guān)光譜基本原理和激光共焦構(gòu)型,利用金納米粒子具有非常強(qiáng)的光散射特性,建立了共振散射相關(guān)光譜新方法(Resonance Light ScatteringCorrelation Spectroscopy,RLSCS)。將這一方法成功地應(yīng)用于金納米粒子的平動和轉(zhuǎn)動行為的研究,濃度的表征。同時應(yīng)用于DNA雜交檢測和蛋白質(zhì)的相互作用研究。主要工作包括以下幾個方面:
　　 1.

4、共振散射相關(guān)光譜是基于納米粒子(如金納米粒子)的共振散射特性建立的一種單顆粒探測新方法。我們參照熒光相關(guān)光譜理論模型,將金納米粒子共振散射光近似地按照熒光相關(guān)光譜中的熒光來處理,建立了散射相關(guān)光譜的理論模型,提出了共振散射相關(guān)光譜概念?；诩す夤步箻?gòu)型,建立共振散射相關(guān)光譜探測系統(tǒng)。對該系統(tǒng)的基本參數(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)的研究和優(yōu)化。顯著地減小了系統(tǒng)的檢測體積(小于1飛升),提高檢測系統(tǒng)的信/背(信號/背景信號)比。該系統(tǒng)能夠獲得粒徑大于15納米

5、金顆粒的共振散射相關(guān)光譜。建立的模型與實驗數(shù)據(jù)很好的吻合。
　　 2.基于散射相關(guān)光譜建立了一種表征金納米粒子的平動擴(kuò)散和轉(zhuǎn)動擴(kuò)散及其濃度的新方法。我們系統(tǒng)的研究了各種因素對金納米粒子的平動擴(kuò)散和轉(zhuǎn)動擴(kuò)散行為的影響。發(fā)現(xiàn)當(dāng)不同波長激光照射時,僅在激光波長處在共振散射峰位置(納米金的共振散射波長為600納米附近)時,金納米粒子的轉(zhuǎn)動擴(kuò)散可以被共振散射相關(guān)光譜探測。為了證實散射相關(guān)光譜曲線中快速運(yùn)動屬于轉(zhuǎn)動擴(kuò)散,設(shè)計了改變針孔孔徑的

6、實驗,我們發(fā)現(xiàn)孔徑由35微米增大到110微米時,其平動擴(kuò)散時間由2.39毫秒相應(yīng)地增大到3.74毫秒；而轉(zhuǎn)動擴(kuò)散時間卻保持6.06微秒不變,這一實驗結(jié)果與預(yù)測相吻合?；诩{米粒子的平動擴(kuò)散時間計算了納米金的動力學(xué)半徑,其動力學(xué)半徑與電鏡測定結(jié)果基本相吻合。從共振散射相關(guān)光譜中獲得檢測體積內(nèi)的粒子個數(shù),用已知擴(kuò)散系數(shù)的熒光染料測定共振散射相關(guān)光譜的檢測體積,據(jù)此,我們建立了金納米粒子的濃度測定方法,其測定結(jié)果與電鏡測定方法基本相吻合。研究

7、結(jié)果表明共振散射相關(guān)光譜是表征納米粒子的一種有效的新方法。
　　 3.我們將共振光散射相關(guān)光譜應(yīng)用到核酸雜交檢測中,建立均相DNA雜交探測新方法。我們首先將兩個不同片段的寡核苷酸探針通過巰基引入到納米金表面,將其與兩個片段互補(bǔ)的靶目標(biāo)DNA加入到體系中,然后用共振光散射相關(guān)光譜檢測納米金聚集體的擴(kuò)散時間和光散射強(qiáng)度來表征納米金的聚集程度。研究發(fā)現(xiàn)隨著靶目標(biāo)DNA的含量不斷增加,納米金聚集體的擴(kuò)散時間和散射光強(qiáng)度也相應(yīng)的增加。用單

8、個堿基錯配的靶目標(biāo)DNA加入到體系中,發(fā)現(xiàn)其擴(kuò)散時間和散射光強(qiáng)度也相應(yīng)的增加,但與完全互補(bǔ)的靶目標(biāo)DNA相比,其增加的程度要弱一些。該方法檢測限達(dá)到0.1 nM,與比色法相比,檢測限提高了100倍左右。研究結(jié)果表明共振光散射相關(guān)光譜能夠很好的區(qū)分DNA堿基序列,同時還可以用于DNA含量的檢測,當(dāng)靶目標(biāo)DNA的濃度在0-36 nM時,聚集體的擴(kuò)散時間與核酸濃度有較好的線性關(guān)系。與比色法的2-3小時相比,該方法是一種快速檢測方法,檢測時間也

9、只需要5分鐘左右。
　　 4.將納米金共振光散射相關(guān)光譜應(yīng)用于生物分子的相互作用研究。以過氧化酶-生物素與親和素相互作用為免疫反應(yīng)模型,通過監(jiān)測反應(yīng)體系中納米金聚集體的擴(kuò)散時間來確定納米金與過氧化酶生物素最佳吸附的pn值以及生物素與親和素反應(yīng)的最佳pH值。用辣根過氧化酶-生物素通過化學(xué)吸附作用修飾到納米金的表面,加入鏈霉親和素(有四個結(jié)合位點)結(jié)合生物素使得納米金偶聯(lián)在一起,通過監(jiān)測納米金聚集體的擴(kuò)散時間測定納米金的聚集程度。隨

10、著鏈霉親和素的濃度增加,實驗發(fā)現(xiàn)金納米粒子聚集體的擴(kuò)散時間也相應(yīng)的延長,當(dāng)鏈霉親和素的濃度達(dá)到65 nM時(恰好鏈霉親和素與生物素的化學(xué)計量比為1:4),聚集體的擴(kuò)散時間達(dá)到最大值。當(dāng)鏈霉親和素為260 nM和780 nM時,發(fā)現(xiàn)聚集體擴(kuò)散時間反而隨著鏈霉親和素濃度的增加而減小。當(dāng)鏈霉親和素大大過量時,鏈霉親和素迅速地包覆在生物素化的納米金表面,從而部分抑制了納米金的交聯(lián)。通過對納米金聚集動力學(xué)的研究,證實了辣根過氧化酶生物素與親和素誘