光催化交聯(lián)法構(gòu)建生物活性界面.pdf

1、生物活性界面是生物芯片、生物傳感器、固定化酶反應(yīng)器以及免疫親和色譜等檢測(cè)、分析、催化、分離純化等技術(shù)手段得以實(shí)現(xiàn)的基礎(chǔ)，實(shí)現(xiàn)生物分子在載體表面高活性、高載量的固載，是進(jìn)一步優(yōu)化、提高各技術(shù)手段的前提。目前，化學(xué)共價(jià)法是構(gòu)建生物活性界面的主流方法，雖可實(shí)現(xiàn)生物分子在載體表面的牢固結(jié)合，但是常規(guī)的化學(xué)共價(jià)法存在反應(yīng)條件苛刻、反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)等諸多問題，常導(dǎo)致生物分子變性、失活從而失去其生理功能。本論文針對(duì)常規(guī)化學(xué)共價(jià)法在固載生物活性分子方面存在的

2、不足，提出了一種基于酚基光催化交聯(lián)反應(yīng)構(gòu)建蛋白質(zhì)分子活性界面的方法。該反應(yīng)反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)時(shí)間短，可最大程度的維持生物分子構(gòu)象的穩(wěn)定，保持生物分子的活性。本論文的研究?jī)?nèi)容包括以下幾個(gè)方面：
　?。?）驗(yàn)證光催化法酚基表面固載活性蛋白的可行性和普適性：通過熒光檢測(cè)的方法驗(yàn)證了光催化反應(yīng)可實(shí)現(xiàn)牛血清白蛋白（BSA）在瓊脂糖凝膠酚羥基表面的有效固載，固載反應(yīng)可在5s內(nèi)完成，且溶液條件溫和。同樣的方法也可實(shí)現(xiàn)生物素化的人免疫球蛋白 G（

3、hIgG）在 Whatman濾紙酚羥基表面的固載。酶活測(cè)定實(shí)驗(yàn)表明光催化反應(yīng)后的脂肪酶仍能保持80%以上的酶活。同時(shí)，利用該方法在瓊脂糖凝膠介質(zhì)上固載的基因重組蛋白A可實(shí)現(xiàn)hIgG的有效吸附和洗脫，吸附量和洗脫率可分別達(dá)到13 mg/mL gel和90%以上，同時(shí)對(duì)BSA的非特異性吸附較低，低于0.6 mg/mL gel。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)采用該方法實(shí)現(xiàn)了親和素—生物素化抗EpCAM抗體在玻璃片表面的固載，該生物活性界面在1 h和3 h內(nèi)對(duì)MC

4、F-7系細(xì)胞的捕獲量達(dá)近10000個(gè)/cm2和25000個(gè)/cm2玻璃片，而常規(guī)法構(gòu)建的親和素—生物素化抗EpCAM抗體界面在1 h和3 h內(nèi)的捕獲量?jī)H約為200個(gè)/cm2和15000個(gè)/cm2玻璃片，遠(yuǎn)低于前者的捕獲效果。上述結(jié)果充分證實(shí)了酚基光催化偶聯(lián)法對(duì)于在不同材料界面固載活性蛋白質(zhì)的有效性，且方法簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速、條件溫和，對(duì)固載的蛋白質(zhì)活性影響較小。
　?。?）酚基光催化交聯(lián)反應(yīng)機(jī)理和影響因素的探究：延長(zhǎng)光照時(shí)間可提高蛋白

5、質(zhì)在瓊脂糖凝膠酚羥基表面的固載量，但固載量提高的程度存在顯著性差異，當(dāng)光照時(shí)間從2 s延長(zhǎng)到15 s時(shí)，hIgG（10 mg/mL）的固載量可從7.80 mg/mL gel增長(zhǎng)到30 mg/mL，而同濃度的BSA的固載量?jī)H從11.47 mg/mL gel增長(zhǎng)到13.82 mg/mL gel。提高蛋白質(zhì)初始濃度是提高蛋白質(zhì)固載量的重要手段，在10 s的光照時(shí)間下，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的濃度從2 mg/mL增加到10 mg/mL，BSA的固載量從3.6

6、4 mg/mL gel增加到12.81 mg/mL gel，hIgG的固載量也從5.47 mg/mL gel提高到了20.74 mg/mL gel。蛋白質(zhì)種類對(duì)光催化交聯(lián)反應(yīng)的影響主要體現(xiàn)在較低分子量的蛋白質(zhì)、含有較多高反應(yīng)活性的氨基酸殘基的蛋白質(zhì)以及含有較多β-折疊片的蛋白質(zhì)更加容易參與光催化交聯(lián)反應(yīng)。通過考察β-巰基乙醇和乙醇胺對(duì)BSA固載量的影響以及硅片酚羥基表面分別偶聯(lián)β-巰基乙醇和乙醇胺后的X射線光電子能譜分析（XPS），證實(shí)

7、氨基和巰基同樣是在酚羥基鄰位形成共價(jià)鍵的方式參與到光催化交聯(lián)反應(yīng)中。
　?。?）光催化交聯(lián)構(gòu)建蛋白質(zhì)凝膠的研究：以纖維蛋白原溶液為原料，通過光催化交聯(lián)反應(yīng)構(gòu)建了以纖維蛋白原凝膠為載體的固定化脂肪酶體系，該體系中纖維蛋白原凝膠的儲(chǔ)能模量（G’）和損耗模量（G’’）可分別達(dá)到了800 Pa和100 Pa，是良好的載體，固定化脂肪酶的固載量可達(dá)30%，酶活可保持45%，高于文獻(xiàn)報(bào)道的其它共價(jià)法制備的固定化酶30%酶活保持率，而在連續(xù)使用

8、5次之后，酶活并未出現(xiàn)顯著性下降，具備良好的重復(fù)使用性能。同樣，利用該方法在硅片表面制備了以纖維蛋白原為基底的蛋白A功能膜，通過 ELISA法測(cè)得該活性界面的吸光值可達(dá)到0.6119，為陰性對(duì)照組的2.64倍，而環(huán)氧法構(gòu)建的蛋白A功能界面，吸光值與陰性對(duì)照組無顯著性差異，表明光催化法較之于環(huán)氧法具有更高的應(yīng)用價(jià)值。
　　總之，本論文提出的光催化交聯(lián)法可實(shí)現(xiàn)功能蛋白質(zhì)活性界面的構(gòu)建，而且較之于常規(guī)法構(gòu)建的蛋白質(zhì)活性界面，具備更加優(yōu)良