β-環(huán)糊精的改性及在核酸純化中的應(yīng)用.pdf

1、DNA是一切生命之源,它的純化備受關(guān)注。DNA所存在的環(huán)境較為復(fù)雜,有效高純度高濃度的純化DNA一直是個(gè)較難的環(huán)節(jié)。本文所運(yùn)用的吸附方法與傳統(tǒng)的手工提取,有機(jī)溶劑純化法等相比,有成本低,操作簡(jiǎn)單沒有有機(jī)溶劑污染等優(yōu)點(diǎn)。環(huán)糊精分子具有錐形的中空?qǐng)A筒立體環(huán)狀的獨(dú)特結(jié)構(gòu),所以本文選用環(huán)糊精為基質(zhì),對(duì)其進(jìn)行簡(jiǎn)單的化學(xué)改性,制備多種環(huán)糊精衍生物,并對(duì)修飾環(huán)糊精進(jìn)行了表征,用于對(duì)DNA的純化。用修飾環(huán)糊精對(duì)DNA進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn),通過探討溶液酸度、離子

2、強(qiáng)度、吸附時(shí)間、DNA初始濃度等因素對(duì)DNA吸附效果的影響,優(yōu)化了吸附條件。將得到的吸附等溫線進(jìn)行模擬處理,探討了修飾環(huán)糊精的吸附機(jī)理。
　　1.選用甲苯-2,4-二異氰酸酯(TDI)為交聯(lián)劑,制備了TDI交聯(lián)β-CD,討論了吸附液組成、溶液酸度、交聯(lián)度等因素對(duì)DNA回收效果的影響。其最佳條件為:在中性條件下,由2.0mol·L-1NaCl,20％PEG8000所組成的溶液進(jìn)行吸附,用TE緩沖液進(jìn)行洗脫,TDI交聯(lián)β-CD對(duì)DNA

3、的回收率可達(dá)100%。將TDI交聯(lián)環(huán)糊精微球應(yīng)用于玉米樣品DNA的分離純化,電泳結(jié)果和紫外測(cè)得的數(shù)據(jù)均證實(shí)DNA被成功提取并洗脫下來,A260/A280在1.7～2.0范圍,濃度較大。
　　2.以環(huán)氧氯丙烷為交聯(lián)劑,乙二胺為氨化試劑,將氨基基團(tuán)接枝在β-CD微球表面制備了 AE-β-CD。選用甲醛為氨基保護(hù)劑,將吸附劑表面的氨基基團(tuán)掩蔽起來,制備了masking AE-β-CD。通過FTIR和XPS能譜對(duì)吸附劑進(jìn)行了表征,表明氨基

4、已成功接枝在β-CD微球表面。AE-β-CD,在 pH5.5的緩沖液含有2.0 mol.L-1 NaCl的吸附液中,5℃條件下,吸附DNA時(shí)間可在10min完成吸附,吸附率最高為57.6%。而maskingβ-CD在條件最優(yōu)的情況下,對(duì)DNA的吸附率只有22.1%。當(dāng)吸附液中加入PEG時(shí),AE-β-CD對(duì)DNA的回收率為54.3%,maskingβ-CD對(duì)DNA的回收率為76.4%。將兩種吸附劑運(yùn)用到純化玉米基因組中,紫外測(cè)定結(jié)果A26

5、0/A280在1.7～2.0范圍內(nèi),瓊脂糖凝膠電泳顯示基因組帶明顯。
　　3.以亞氨基二乙酸(IDA)為螯合配基,制備了螯合 Zn2+、Cu2+、Fe3+的三種親和吸附劑。通過FTIR和XPS能譜對(duì)IDA-β-CD進(jìn)行表征表明,IDA成功接枝在β-CD微球上。通過金屬離子含量的測(cè)定表明IDA修飾后β-CD微球?qū)饘匐x子的螯合量明顯高于修飾前β-CD微球,進(jìn)一步證實(shí)IDA成功修飾在β-CD微球表面。對(duì)DNA進(jìn)行吸附,實(shí)驗(yàn)表明:當(dāng)pH

6、為5.0的吸附液含有2.0 mol.L-1 NaCl在低溫時(shí), Zn-IDA-β-CD、Cu-IDA-β-CD、Fe-IDA-β-CD對(duì)DNA的實(shí)驗(yàn)最大吸附容量分別為63.66、88.47、18.34 mg.g-1。吸附等溫線用Langmuir和Freundlich模型進(jìn)行擬合,三種吸附劑對(duì)DNA的吸附過程更符合Freundlich模型,證明DNA的吸附是多分子層吸附。
　　4.以雙甘膦(PMIDA)修飾劑對(duì)環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)β-CD

7、進(jìn)行改性,將Zn2+、Cu2+、Fe3+螯合在PMIDA-β-CD上。通過FTIR對(duì)PMIDA-β-CD進(jìn)行表征的結(jié)果表明, PMIDA已成功接枝在交聯(lián)β-CD微球上。通過修飾后剩余的 PMIDA測(cè)定得到PMIDA在β-CD微球表面的修飾量。金屬離子負(fù)載量的測(cè)定表明PMIDA修飾后β-CD微球?qū)饘匐x子的螯合量明顯高于修飾前β-CD微球,可進(jìn)一步證實(shí)PMIDA成功修飾在交聯(lián)β-CD表面。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:Zn-PMIDA-β-CD, Cu-