蛋白質(zhì)直接電化學(xué)和去折疊及與小分子相互作用的研究.pdf

1、研究蛋白質(zhì)的直接電子傳遞、蛋白質(zhì)折疊/去折疊的構(gòu)象變化及其與小分子的相互作用，可以獲得蛋白質(zhì)的熱力學(xué)和動力學(xué)性質(zhì)的重要信息，以及藥物等小分子與蛋白質(zhì)相結(jié)合的動態(tài)信息，為構(gòu)筑新型第三代電化學(xué)生物傳感器提供了重要基礎(chǔ)。本課題的研究有助于理解和認識蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系，對于蛋白質(zhì)的定量檢測和新藥的開發(fā)也具有重要意義。本論文共分5章，其主要內(nèi)容分別如下： 1.綜述了蛋白質(zhì)的直接電化學(xué)、蛋白質(zhì)的折疊/去折疊、蛋白質(zhì)與小分子化合物的

2、相互作用三方面的研究意義、方法和進展等。簡述了本論文的選題意義和主要內(nèi)容。 2.構(gòu)建了新的蛋白質(zhì)薄膜修飾電極體系，實現(xiàn)了辣根過氧化物酶(HRP)的直接電化學(xué)和生物催化作用。殼聚糖穩(wěn)定的納米金(AuCS)與片狀剝落的粘土(Clay)納米片通過靜電相互作用進行雜化，制備得到粘土—殼聚糖—納米金復(fù)合物(Clay/AuCS)。HRP被固定在Clay/AuCS修飾的玻碳電極上，最后再覆蓋一層粘土。紫外—可見光譜(UV—Vis)表明HRP在

3、修飾膜里保持了它的天然構(gòu)象。X—射線衍射(XRD)結(jié)果說明在修飾膜變干的過程中，HRP、AuCS和Clay之間發(fā)生了一個相互穿插—脫落—重新堆疊的過程。在0.1 M pH7.0的磷酸緩沖溶液中，HRP在—0.195 V顯示一對準可逆的氧化還原峰。該修飾電極用于檢測H2O2時電流響應(yīng)快速，線性范圍是39μM—3.1 mM，檢出限是9μM。動力學(xué)參數(shù)，如電荷轉(zhuǎn)移系數(shù)、電子轉(zhuǎn)移速率常數(shù)和米氏常數(shù)分別為0.53、2.95±0.20 s-1和23

4、.15 mM。 3.實現(xiàn)了肌紅蛋白(Mb)在Clay/AuCS修飾電極上的直接電化學(xué)和生物催化作用。Mb被固定在Clay/AuCS修飾的玻碳電極和外層的粘土保護層之間。使用電化學(xué)方法、UV—Vis和XRD對該修飾體系進行了表征。在該修飾體系里，Mb的XRD結(jié)果與HRP的完全不同，說明蛋白質(zhì)所帶的凈電荷能通過影響修飾膜中各層物質(zhì)之間的相互作用，從而使粘土的基面間距發(fā)生變化。通過對H2O2和NaNO2的還原，考察了Mb在該修飾電極上

5、的生物催化活性。 4.建立了血紅蛋白(Hb)去折疊的模型。通過考察heme FeⅢ/FeⅡ的電化學(xué)響應(yīng)，研究了尿素和/或pH誘導(dǎo)Hb去折疊的構(gòu)象變化。此外，使用光譜技術(shù)進一步進行表征。結(jié)果表明，酸對Hb構(gòu)象的影響明顯大于堿和濃尿素：當(dāng)使用尿素或者強堿變性時，Hb被去折疊但heme—咪唑連接鍵沒有斷開；然而，當(dāng)使用強酸(pH<4)變性時，heme—咪唑鍵斷裂。通過建立的熱力學(xué)循環(huán)證明，用尿素誘導(dǎo)去折疊時，還原態(tài)Hb的穩(wěn)定性明顯高于

6、氧化態(tài)Hb。通過優(yōu)化變性條件來控制Hb的去折疊態(tài)，從而使Hb的過氧化物酶活性增強了約18倍。光譜和電化學(xué)的結(jié)果高度吻合。表明電化學(xué)方法也能成為一個靈敏的手段用于蛋白質(zhì)去折疊的研究。 5.建立了定量分析牛血清蛋白(BSA)的電化學(xué)方法。在pH5.0的HAc—NaAc緩沖溶液中，使用電化學(xué)方法研究了BSA和ARS的相互作用，并闡明了BSA和茜素紅S(ARS)的結(jié)合機理和結(jié)合位點。ARS和BSA主要通過疏水作用和氫鍵作用力形成了非電活