右旋糖酐蔗糖酶分子改造及其催化性質(zhì)研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)室前期從腸膜狀明串珠菌Leuconostoc mesenteroides0326的右旋糖酐蔗糖酶dextransucrase(EC2.4.1.5)中克隆獲得基因dex-YG，并以該基因?yàn)榛A(chǔ)構(gòu)建了右旋糖酐蔗糖酶大腸桿菌表達(dá)體系的工程菌。右旋糖酐蔗糖酶以蔗糖為底物通過水解轉(zhuǎn)移葡萄糖基合成高分子葡聚糖。本文通過對(duì)右旋糖酐蔗糖酶基因dex-YG進(jìn)行系列分子截短，分析不同片段的右旋糖酐截短突變酶的特性，以探究右旋糖酐蔗糖酶結(jié)構(gòu)區(qū)域與催化功

2、能的關(guān)系，揭示其催化機(jī)制;在此基礎(chǔ)上選定特定區(qū)域能進(jìn)行氨基酸定點(diǎn)突變、嵌入突變，獲得不同酶學(xué)性質(zhì)的正突變酶，探究其控制產(chǎn)物特異性的催化機(jī)制，獲得催化合成不同枝化度的新型右旋糖酐產(chǎn)物，擴(kuò)大該酶的應(yīng)用領(lǐng)域。
　　1、以右旋糖酐蔗糖酶基因序列dex-YG為基礎(chǔ)，通過生物信息學(xué)的比對(duì)分析，對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)以及三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，對(duì)其C端序列進(jìn)行一系列的截短，分析其結(jié)構(gòu)功能的關(guān)系。通過片段截短的方法對(duì)其糖鏈延伸的控制區(qū)，寡聚糖合成區(qū)域，以及完

3、全保守區(qū)域進(jìn)行了研究分析，探討右旋糖酐蔗糖酶結(jié)構(gòu)區(qū)域與催化功能的關(guān)系。結(jié)果表明:對(duì)其末端重復(fù)序列進(jìn)行刪除，會(huì)極大的破壞右旋糖酐蔗糖酶合成葡聚糖的能力。隨截短片段長度增加，其合成高分子葡聚糖的能力急劇下降，在蛋白367aa個(gè)氨基酸的截短后，其右旋糖酐的合成能力完全喪失，相對(duì)應(yīng)的其受體反應(yīng)的催化功能會(huì)明顯增強(qiáng)，從而導(dǎo)致寡聚糖的合成能力顯著提升。隨著更進(jìn)一步的片段截短直至其保守序列motifⅠ，其受體反應(yīng)的催化性能也極具下降，其酶活力幾乎完全

4、喪失。
　　2、不同類型的糖酐水解酶其合成的葡聚糖其糖苷鍵的組成卻又很大的區(qū)別，包括α(1-2)、α(1-3)、α(1-4)、α(1-6)糖苷鍵。通過對(duì)分子對(duì)接以及動(dòng)力學(xué)的模擬分析，對(duì)受體以及底物結(jié)合區(qū)域的關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行替換，通過分析其對(duì)合成產(chǎn)物的影響結(jié)合分子模擬的分析結(jié)構(gòu)，探究其控制產(chǎn)物的催化機(jī)制，合成不同鍵型的右旋糖酐產(chǎn)物，擴(kuò)大該酶的應(yīng)用領(lǐng)域。通過對(duì)關(guān)鍵位點(diǎn)的氨基酸替換，相對(duì)于原始的右旋糖酐蔗糖酶的催化產(chǎn)物右旋糖酐5％α(1-

5、3)以及95％α(1-6)鍵型組成，突變后的鍵型組成變?yōu)?-9％α(1-3)和90-98％α(1-6)鍵型組成，部分突變產(chǎn)生了額外的α(1-2)鍵和α(1-4)鍵。模擬分析可以發(fā)現(xiàn)，替換氨基酸其側(cè)鏈的大小、電荷狀況以及疏水性等都會(huì)較大的影響受體結(jié)合最穩(wěn)定構(gòu)象，從而影響酶學(xué)性質(zhì)以及產(chǎn)物特異性等。
　　3、對(duì)催化口袋中的特定氨基酸進(jìn)行替換會(huì)在一定程度的影響產(chǎn)物的鍵型，但其變化有一定的局限性。通過對(duì)不與底物或受體直接作用的保守序列的關(guān)鍵

6、位點(diǎn)進(jìn)行氨基酸插入突變，會(huì)更大程度改變產(chǎn)物右旋糖酐的鍵型。以同源重組的方式對(duì)663以及553位點(diǎn)進(jìn)行氨基酸的飽和嵌入，通過對(duì)活性菌株的篩選以及協(xié)同突變，獲得了超高分支葡聚糖產(chǎn)物突變株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到氨基酸嵌入的突變方式雖然會(huì)在一定程度影響酶活性，但其得到的突變體催化性質(zhì)變化顯著。更進(jìn)一步的協(xié)同突變表明，其產(chǎn)物特異性變化更加顯著。
　　綜上，本文通過對(duì)右旋糖酐蔗糖酶基因的分子截短、定點(diǎn)突變和嵌入突變，探討了右旋糖酐蔗糖酶結(jié)構(gòu)區(qū)域與催化