CDX2基因過表達對潰瘍性結腸炎模型大鼠結腸組織中MUC2蛋白的影響.pdf

1、目的:構建攜帶并穩(wěn)定表達尾側型同源轉錄因子2（CDX2）基因的大鼠骨髓間充質干細胞（BMSCs），為大鼠潰瘍性結腸炎模型的基因治療提供工具；探討CDX2基因過表達對潰瘍性結腸炎大鼠模型中MUC2蛋白的作用；
　　方法:
　　1、CDX2基因重組慢病毒載體的構建及鑒定
　　設計CDX2引物，采用PCR擴增CDX2基因片段;通過In-Fusion技術將目的基因片段連接到線性質粒載體中，然后轉化感受態(tài)細胞，進行陽性克隆篩選及

2、基因測序。將重組載體轉染293T細胞，進行慢病毒包裝、濃縮，并用熒光法進行滴度測定。
　　2、大鼠BMSCs的培養(yǎng)、轉染及鑒定
　　采用骨髓貼壁法體外分離并培養(yǎng)雄性 Wistar大鼠骨髓間充質干細胞，流式細胞儀（FACS）檢測細胞免疫表型。將攜帶CDX2基因的慢病毒載體轉染至大鼠骨髓間充質干細胞，利用RT-PCR及Western blot等技術檢測干細胞中CDX2 mRNA及蛋白的表達水平。
　　3、大鼠UC模型的誘導

3、及分組處理
　　采用5%2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-TNBS)/無水乙醇化學法誘導雌性大鼠潰瘍性結腸炎（UC）疾病模型；再次采用FACS檢測經慢病毒轉染后的細胞免疫表型；分別將1ml生鹽水（NS，B組）、骨髓間充質干細胞（BMSCs，C組）、空載慢病毒轉染后的骨髓間充質干細胞（LV-BMSCs，D組）、攜帶CDX2的慢病毒轉染后的骨髓間充質干細胞（CDX2-BMSCs，E組）經鼠尾靜脈注射移植到UC模型大鼠體內，另外設未

4、處理的大鼠為正常對照組（A組）。
　　4、干預后不同組別大鼠量化評分
　　對不同組別大鼠的急性疾病活動指數(shù)（DAI）評分；取移植治療后7天的大鼠結腸組織肉眼及光鏡下（HE染色）觀察其損傷變化，并對其進行結腸組織大體形態(tài)損傷指數(shù)(colon macroscopic damage index，CMDI)、組織損傷指數(shù)（The scoring criteria of tissue damage index，TDI）量化評分。

5、>　　5、制備組織冰凍切片在熒光顯微鏡下觀察增強綠色熒光蛋白（EGFP）的表達情況。
　　6、檢測大鼠結腸組織SRY、CDX2、MUC2的表達
　　經 PCR技術檢測大鼠結腸組織內是否表達雄性鼠特異性的 SRY基因，采取RT-PCR及 Western Blot技術檢測不同組 CDX2 mRNA和蛋白的表達情況；用Western Blot技術檢測不同組別MUC2蛋白的表達情況。
　　結果:
　　1、PCR、DNA測

6、序及WB檢測結果表明成功構建重組Ubi-CDX2-MCS-3FLAG-CMV-EGFP慢病毒載體，測定滴度為2×108TU/ml。
　　2、FACS鑒定結果顯示，大鼠BMSCs表達CD29、CD73、CD90，而不表達CD34和CD45，符合骨髓間充質干細胞的表型，成功完成大鼠骨髓間充質干細胞的分離與培養(yǎng)。RT-PCR及Western blot結果顯示CDX2基因轉染至大鼠BMSCs并能穩(wěn)定表達，成功構建攜帶CDX2基因的BMSC

7、s系統(tǒng)。
　　3、給予5%TNBS/無水乙醇灌腸處理后，大鼠出現(xiàn)厭食、扎堆、體重下降、腹瀉等結腸炎癥狀，在第3天各實驗組DAI評分較正常組明顯增高，但組間無顯著差異（F=0.39,P>0.05）；FSCS結果提示慢病毒轉染后的細胞依然表現(xiàn)出骨髓間充質干細胞的免疫表型。
　　4、給予不同處理的骨髓間充質干細胞移植治療后第7天，E組大鼠DAI、CMDI、TDI評分明顯低于B、C、D組（P<0.05）,C、D兩組分別低于B組（P<

8、0.05），而C、D兩組間無明顯差異（P>0.05）。
　　5、熒光顯微鏡下觀察各組冰凍切片發(fā)現(xiàn)只有 D、E兩組可見大量熒光，其他組均無熒光表達，說明慢病毒轉染成功。
　　6、SRY基因的PCR定性檢測發(fā)現(xiàn)C、D、E三組在213bp處可見電泳條帶，說明雄性大鼠的骨髓間充質干細胞成功移植到大鼠體內并歸巢到結腸組織。通過QRT-PCR和WB技術定量檢測大鼠結腸組織CDX2 mRNA、CDX2蛋白和MUC2蛋白發(fā)現(xiàn)，E組較B、C、

9、D組表達增加（P<0.05），B組表達量最低，明顯低于其他各組（P<0.05）,C、D兩組間無差異（P>0.05）。
　　結論:
　　1、成功構建了穩(wěn)定過表達CDX2基因的雄性大鼠BMSCs并移植到雌性大鼠體內；
　　2、采用5%TNBS/無水乙醇成功誘導出大鼠潰瘍性結腸炎模型，為進一步的實驗奠定基礎；
　　3、首次通過慢病毒載體借助骨髓間充質干細胞組作為運載細胞將目的基因CDX2轉染到大鼠體內過表達，探討了該基