酶促高效轉(zhuǎn)化L-絲氨酸過程優(yōu)化及其生命周期評價.pdf

1、作為一種常見的組成蛋白質(zhì)的氨基酸，L-絲氨酸主要應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域。生物體內(nèi)，L-絲氨酸可以用于合成嘌呤、胸腺嘧啶、膽堿等前體，L-絲氨酸還可作為中間體，用于合成L-色氨酸、L-多巴、L-半胱氨酸等物質(zhì)。L-絲氨酸合成方法中，酶法以良好的催化專一性、反應(yīng)條件溫和、易滿足等優(yōu)點成為生產(chǎn)和研究的主要方向。但是，酶法合成L-絲氨酸存在檢測技術(shù)落后、轉(zhuǎn)化率低、產(chǎn)酸量低、污染嚴(yán)重等問題，為了解決上述酶法合成L-絲氨酸工藝存在的技術(shù)難題

2、，本文開展了詳細(xì)研究并得出如下主要結(jié)論：
　?。?）建立了一種新型的靈敏度高、重現(xiàn)性和選擇性好的HPLC–ESI-MS測定氨基酸含量的方法。A流動相：0.01％甲酸水溶液，B流動相：乙腈：水=70：30（v/v），流速為1 mL min?1，采用Agilent Eclipse plus C18(4.6 mm×250 mm×5μm)色譜柱，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量為10μL，UV檢測波長為254 nm。洗脫梯度：0 min=90%A a

3、nd10%B，12 min=70%A and30%B，20 min=52%A and48%B，30 min=100%B，29分鐘內(nèi)實現(xiàn)了15種氨基酸徹底分離及確認(rèn)。
　　（2）根據(jù)建立的HPLC–ESI-MS定量、確認(rèn)氨基酸新方法，對15種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的總離子流結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PITC-AA產(chǎn)物離子具有從母核分子上失去NH3（17 Da）、H2O（18 Da）或CO+H2O（46 Da）離子的特征。對建立的HPLC–ESI

4、-MS新方法進(jìn)行驗證、評估，發(fā)現(xiàn)混合溶液中所含15種氨基酸，其對應(yīng)的線性范圍為630–20156μmol L?1，LOD、LOQ范圍分別為111–816、311–2721 pmolμL?1，日內(nèi)、日間精密度分別為0.924%–6.578%(n=6)、3.327%–9.845%(n=6 in3 d)，PITC-AA平均回收率為82.6%–112.0%。
　　（3）通過對酶法合成L-絲氨酸工藝過程的優(yōu)化研究，提供了一種高轉(zhuǎn)化率的酶法生

5、成L-絲氨酸方法。首先對影響轉(zhuǎn)化反應(yīng)的SHMT活性的因素進(jìn)行優(yōu)化，確定了pH8.0，50℃，CTAB0.03g L?1，DL-β-200μmol L?1，PLP0.012g L?1條件下，SHMT酶活最高可達(dá)1.246 U mg?1，進(jìn)一步研究了酶促轉(zhuǎn)化過程高濃度HCHO導(dǎo)致的反應(yīng)體系pH下降、抑制底物轉(zhuǎn)化的問題，提出了以1.3 mmol h-1流速滴加HCHO的策略，控制反應(yīng)體系pH為7.5，實現(xiàn)了甘氨酸的高效轉(zhuǎn)化，最終轉(zhuǎn)化率高達(dá)95

6、.6%，與未采取滴加策略之前相比，轉(zhuǎn)化率提高近10%。
　　（4）研究建立了一種高收率制備產(chǎn)物L(fēng)-絲氨酸的工藝路線。通過對影響吸附和洗脫過程的參數(shù)優(yōu)化，確定了上樣溶液pH為9.0、吸附平衡時間20 min、洗脫劑為0.2磷酸緩沖液（pH5.0）、洗脫速度為0.4 mL min-1，50℃條件下，濃縮洗脫液至10:1（v/v）、60℃脫色30 min、過濾、冷卻、加入96%（v/v）甲醇溶液結(jié)晶3 h，80℃溶解、二次脫色、冷卻、陳

7、化結(jié)晶，80℃干燥，最終L-絲氨酸收率達(dá)75.17%。分離純化過程排放的主要污染物為離子交換分離階段排放的酸堿廢水，離子交換、脫色過程產(chǎn)生的廢樹脂、活性炭渣等，精制干燥工序產(chǎn)生的少量粉塵。
　?。?）首次采用生命周期評價方法對酶法合成L-絲氨酸工藝產(chǎn)生的環(huán)境影響進(jìn)行分析和定量。以年產(chǎn)500 t酶法合成L-絲氨酸工藝為研究對象，以菌體CTAB處理為研究起點，以產(chǎn)物干燥為終點，建立生命周期評價模型，通過各項指標(biāo)數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化處理、加權(quán)評