Calcimycin(A23187)生物合成機(jī)理的研究.pdf

1、Calcimycin(A23187)是重要的聚醚類抗生素,不僅具有抗革蘭氏陽(yáng)性菌的作用,還是哺乳動(dòng)物細(xì)胞的氧化磷酸化的解偶聯(lián)劑和ATP酶的抑制劑,甚至引起細(xì)胞凋亡。Calcimycin(A23187)可特異地結(jié)合二價(jià)金屬陽(yáng)離子(鈣離子、鎂離子等),常用于鈣離子穿膜時(shí)細(xì)胞膜生理屬性的研究中。Calcimycin(A23187)的化學(xué)結(jié)構(gòu)包含3個(gè)部分:α-酮吡咯環(huán)、螺旋環(huán)和氨甲基取代的苯并嗯唑環(huán)。同位素喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明吡咯環(huán)來(lái)源于脯氨酸,螺旋環(huán)

2、來(lái)源于2分子的乙酸和4分子的丙酸,苯并噁唑環(huán)來(lái)源于分支酸途徑的3.羥基鄰氨基苯甲酸,N-甲基來(lái)源于甲硫氨酸。鑒于calcimycin(A23187)獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)與作用機(jī)理,科學(xué)家們長(zhǎng)期以來(lái)對(duì)其表現(xiàn)出濃厚的興趣,自從1972年發(fā)現(xiàn)以來(lái),16,000多篇文獻(xiàn)報(bào)道了calcimycin(A23187)的相關(guān)研究,但是其生物合成機(jī)理一直懸而未決。本研究旨在分子水平上闡述calcimycin(A23187)的生物合成機(jī)理,從而為利用組合生物學(xué)手

3、段開發(fā)新的藥物奠定基礎(chǔ)。
　　 根據(jù)脯氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶的保守氨基酸區(qū)域設(shè)計(jì)兼并引物,通過(guò)PCR的方法克隆到了脯氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶基因,進(jìn)而從教酒鏈霉菌(Streptomyces chartreusis)NRRL3882的基因組文庫(kù)中克隆到了calcimycin(A23187)的生物合成基因簇,并從中挑選p14F11、p16F9和p6F5三個(gè)相互重疊的陽(yáng)性科斯質(zhì)粒拿去測(cè)序。生物信息學(xué)顯示測(cè)定的101 kb的區(qū)域含有56個(gè)開放閱讀框(op

4、en reading frame,ORF),其中的27個(gè)ORFs(64 kb)負(fù)責(zé)calcimycin(A23187)的生物合成。這27個(gè)orfs包含:3個(gè)orfs(calN1-N3)負(fù)責(zé)吡咯環(huán)的合成,5個(gè)orfs(calA1-A5)編碼I型聚酮合酶負(fù)責(zé)螺旋環(huán)的合成,4個(gè)orfs(calB1-B4)負(fù)責(zé)3-羥基鄰氨基苯甲酸的合成,1個(gè)N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因(calM),1個(gè)抗性基因(calT),1個(gè)Ⅱ型硫酯酶(calG),3個(gè)調(diào)節(jié)基因(ca

5、lR1-R3),4個(gè)其它基因(calCDFH)和5個(gè)未知基因(calU1-U5)。通過(guò)同框缺失目標(biāo)基因,確定了4個(gè)基因(calN1、calN2、calB2和calM)跟calcimycin(A23187)的生物合成直接相關(guān),并體外酶活實(shí)驗(yàn)證實(shí)了CalM催化A23187的最后一步N-轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)。以此為基礎(chǔ)結(jié)合生物信息學(xué)分析和早期的同位素喂養(yǎng)結(jié)果成功推測(cè)出了calcimycin(A23187)的整個(gè)生物合成途徑。
　　 CalN1是

6、輔氨酰基脫氫酶,催化輔氨酰的脫氫反應(yīng),生成吡咯環(huán)。CalN2是脯氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶,特異識(shí)別并活化脯氨酸。CalB2是異分支酸酶,催化2-氨基-2-脫氧異分支酸(ADIC)生成2,3-氫-3-羥基鄰氨基苯甲酸(DHHA)。CalM是N-甲基轉(zhuǎn)移酶,催化calcimycin(A23187)生物合成的最后一步,使中間產(chǎn)物N-demethyl calcimycin(A23187)生成calcimycin(A23187)。體內(nèi)中斷實(shí)驗(yàn)證明,calN

7、1N282M與calcimycin(A23187)的生物合成直接相關(guān),calN1、calN2、calB2分別同框缺失的突變株都不僅失去了生產(chǎn)calcimycin(A23187)的能力,同時(shí)還失去了生產(chǎn)cezomycin和N-demethyl calcimycin(A23187)這2種中間產(chǎn)物的能力;calM同框缺失的突變株失去了生產(chǎn)calcimycin(A23187)的能力,但是仍然積累了大量的cezomycin和N-demethy1

8、calcimycin(A23187)這2種中間產(chǎn)物;calN2、calM的各自回補(bǔ)菌株都恢復(fù)了生產(chǎn)這3種抗生素的能力;CalM的體外酶活實(shí)驗(yàn)證明,在S-腺苷甲硫氨酸(SAM)存在下,CalM催化中間產(chǎn)物N-demethyl calcimycin(A23187)生成calcimycin(A23187),這一結(jié)果與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)一致。
　　 Calcimycin(A23187)的生物合成起始于脯氨酸,經(jīng)過(guò)腺苷化、脫氫等步驟生成吡咯環(huán),接著