三分三中托品烷生物堿合成途徑中關(guān)鍵酶基因的克隆及特征分析.pdf

1、托品烷生物堿是一類(lèi)從茄科植物如莨菪，曼陀羅及三分三等植物中提取到的抗膽堿藥，主要作用于副交感神經(jīng)系統(tǒng)，具有麻醉、解痙、止痛等功能，在臨床上有著十分廣泛的用途，市場(chǎng)上供不應(yīng)求。其中莨菪堿(hyoscyamine)和東莨菪堿(scopolamine)是托品烷生物堿的兩種主要作用成分，在植物中含量低。因此，利用現(xiàn)代生物技術(shù)，將托品烷生物堿合成途徑中關(guān)鍵酶基因?qū)牒衅吠樯飰A植物中獲得轉(zhuǎn)基因發(fā)根系，繼而進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，是提高托品烷生物堿產(chǎn)量的

2、最佳途徑。 本研究以藥用植物三分三(Anisodus acutangulus)為材料，克隆托品烷生物堿合成途徑中的兩個(gè)關(guān)鍵酶基因：腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因(AaPMT)和莨菪堿6 β-羥化酶基因(AaH6H)；并對(duì)基因的特征、表達(dá)分析、誘導(dǎo)調(diào)控等方面開(kāi)展了一系列的研究，獲得了以下的結(jié)果： 一．首次克隆了莨菪堿生物合成途徑中關(guān)鍵酶“三分三腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶”的編碼基因AaPMT,該基因全長(zhǎng)cDNA為1237bp，含有一個(gè)96

3、0bp的開(kāi)放閱讀框，編碼一個(gè)具有319個(gè)氨基酸的多肽，推測(cè)該蛋白的等電點(diǎn)為5.51，分子量大小約為35.1kDa。生物信息學(xué)分析表明，從三分三植物中分離得到的AaPMT基因與從其他含托品烷生物堿植物中分離到的PMT基因具有高度的同源性，屬于S-腺苷甲硫胺酸依賴(lài)的甲基轉(zhuǎn)移酶基因家族。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，AaPMT蛋白同其他S-腺苷甲硫胺酸依賴(lài)的甲基轉(zhuǎn)移酶來(lái)自共同的祖先，并且同顛茄及唐古特山莨菪中 PMT蛋白具有最近的親緣關(guān)系。Sothern

4、雜交結(jié)果顯示PMT在三分三中可能存在雙基因。 二．首次克隆了莨菪堿生物合成途徑中關(guān)鍵酶“莨菪堿6 β-羥化酶”的編碼基因AaH6H該基因全長(zhǎng)cDNA為1392bp，含有一個(gè)1032bp的開(kāi)放閱讀框，編碼一個(gè)具有344個(gè)氨基酸的多肽，推測(cè)該蛋白的等電點(diǎn)為5.09，分子量大小約為 38.7kDa。生物信息學(xué)分析表明，從三分三植物中分離得到的AaH6H基因與從其他含托品烷生物堿植物分離到的H6H基因具有高度的同源性，屬于2-氧-戊二酸

5、依賴(lài)的二氧合酶基因家族。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明AaH6H基因與唐古特山莨菪中克隆的H6H基因具有最近的親緣關(guān)系。Southern雜交揭示AaH6H基因?qū)儆谝粋€(gè)多基因家族。組織特異性表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，AaH6H基因在根、莖、葉三種組織中都有表達(dá)，表明AaH6H是一種組成型表達(dá)基因，這在含托品烷生物堿植物中還是首次發(fā)現(xiàn)。甲基茉莉酸誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)揭示，AaH6H在三分三不同部位具有不同的表達(dá)調(diào)控方式。 三．構(gòu)建以煙草花椰菜病毒(CaMY 35S)啟