巖黃連中小檗堿型生物堿生物合成途徑相關基因的研究及藜蘆中甾體.pdf

1、第一部分巖黃連中小檗堿型生物堿生物合成途徑相關基因的研究巖黃連為罌粟科植物石生黃堇(Corydalis saxicola Bunting)的全草，是一種名貴的中藥材主要分布在貴州，云南，四川，廣西等省，對環(huán)境條件要求十分苛刻，野生狀態(tài)下只生長在石灰?guī)r地區(qū)陰濕的巖洞口，被列入中國南部瀕危植物名錄。巖黃連具有清熱解毒、利濕、止痛止血之功效，在臨床上主要藥理活性有抗菌，抗病毒，抗癌。
　　 巖黃連中的活性成分為小檗堿型生物堿類化合物,

2、而這類化合物具有潛在的抗HBV 活性和肝保護活性。
　　 本文對巖黃連中小檗堿類生物堿生物合成途徑中的相關酶基因進行了克隆、表達及功能分析。
　　 巖黃連中(S)-四氫小檗堿氧化酶的克隆，表達及功能分析(S)-四氫小檗堿氧化酶是小檗堿生物合成途徑中的關鍵酶，是黃連小檗堿的合成途徑中最后一個酶，將(S)-四氫小檗堿氧化成小檗堿。通過RACE 獲得了(S)-四氫小檗堿氧化酶cDNA 全長序列，其長度為1127bp，含有5 '

3、-UTR，3'-UTR，ploy (A)+結構以及一個699bp的開放閱讀框架，編碼232個氨基酸殘基,預測分子量為25.20kDa。
　　 將該基因注冊到GenBank,編號為HQ393909。RT-PCR分析表示(S)-THBO在巖黃連植株的根、莖、葉、花中都有表達，在根中表達量最高。誘導實驗表明(S)-THBO 具有明顯的防御作用。
　　 將(S)-四氫小檗堿氧化酶構建表達載體并在大腸桿菌中表達，并對表達(S)-四

4、氫小檗堿氧化酶的大腸桿菌對底物進行體內轉化。表達(S)-四氫小檗堿氧化酶的大腸桿菌可以體內轉化(S)-四氫小檗堿氧化成小檗堿，但對底物有一定的選擇性，不能將內消旋四氫小檗堿轉化完全。
　　 巖黃連中(S)-去甲烏藥堿合成酶的克隆(S)-去甲烏藥堿合成酶是原小檗堿生物合成途徑中的第一個酶，它可以將多巴胺(Dopamine)和(4-羥苯乙酮4-hydroxyphenylhydroxyphenylacetaldehyde，(4-HPA

5、A)）催化成(S)-去甲烏藥堿（(S)-Norcoclaurine)。對巖黃連的總RNA 進行PT-PCR 得到一段(S)-去甲烏藥堿合成酶的核心片段。通過RACE 獲得了(S)-去甲烏藥堿合成酶cDNA 全長序列，其長度為1003bp，含有5'-UTR, 3'-UTR,ploy (A)+結構以及一個621bp的開放閱讀框架，編碼207個氨基酸殘基。將該基因注冊到GenBank，編號為JF488074。
　　 巖黃連中氫化小檗堿