固定化β-葡萄糖苷酶制備及連續(xù)水解虎杖苷的研究.pdf

1、以戊二醛為交聯(lián)劑、碳酸鈣為致孔劑,反相懸浮交聯(lián)制備出交聯(lián)殼聚糖微球;用二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)縮合交聯(lián)殼聚糖微球和賴氨酸,制備出交聯(lián)殼聚糖-賴氨酸樹(shù)脂;以交聯(lián)殼聚糖-賴氨酸樹(shù)脂為載體制備固定化β-葡萄糖苷酶;制備固定化β-葡萄糖苷酶的最佳工藝條件為:交聯(lián)反應(yīng)時(shí)間3.0h,磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液pH7.0,β-葡萄糖苷酶:戊二醛:載體游離氨基的摩爾比為1.8×10-4﹕1﹕1。制得的固定化β-葡萄糖苷酶活力為32.24U/mg,酶蛋

2、白偶聯(lián)率為62.02％,活力回收達(dá)80.9%。以對(duì)硝基苯基-β-D-葡萄糖苷為底物,測(cè)得固定化β-葡萄糖苷酶的主要酶學(xué)性質(zhì)為:最適pH區(qū)間5.5～6.5,最適溫度區(qū)間40～50℃,米氏常數(shù)Km=47.69mmol/L,為游離β-葡萄糖苷酶的1.11倍;65℃半衰期為15.7h,40℃重復(fù)使用半衰期為44次,4℃貯存半衰期為295天。以固定化β-葡萄糖苷酶裝配成柱式生物反應(yīng)器(φ1.2×40),用于連續(xù)水解虎杖苷制備白藜蘆醇,最佳工藝條件

3、為:溫度45℃,pH7.0,底物濃度為2.0%(w/v),流速為1.0mL/min。在此條件下,虎杖苷單次水解率達(dá)51.31%。連續(xù)循環(huán)水解8h,虎杖苷水解率達(dá)85.8%,固定化β-葡萄糖苷酶的剩余活力為82.17%,連續(xù)水解半衰期為24.23h。篩選出大孔吸附樹(shù)脂XAD-7HP分離白藜蘆醇,該樹(shù)脂對(duì)白藜蘆醇和虎杖苷的批式吸附容量分別為:37.63mg/g和25.47mg/g,吸附平衡時(shí)間均為2h;上柱流速為1mL/min時(shí),XAD-7

4、HP對(duì)白藜蘆醇和虎杖苷柱式動(dòng)態(tài)吸附量分別為30.04mg/g和20.36mg/g。用200mL70%乙醇為洗脫劑,洗脫流速為2mL/min對(duì)白藜蘆醇柱式洗脫率達(dá)92.58%;用200mL40%乙醇為洗脫劑,以洗脫流速為2mL/min對(duì)虎杖苷柱式洗脫率達(dá)98.58%。XAD-7HP對(duì)分離水解混合液的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,通過(guò)40%,70%乙醇依次洗脫,獲得的洗脫液經(jīng)高效液相色譜分析指出XAD-7HP可實(shí)現(xiàn)白藜蘆醇和虎杖苷的有效分離,得到高純度白藜