磁性納米顆粒定向固定化β-葡萄糖苷酶的研究.pdf

1、通過有機高分子化合物對磁性納米顆粒的修飾，得到比表面積大、超順磁性、表面易功能化修飾的金屬離子絡合磁性納米顆粒，以其為載體得到的固定化酶在催化體系中幾乎沒有傳質(zhì)阻力，且能夠通過外加磁場對固定化酶進行分離、再利用。而且，傳統(tǒng)的酶固定化技術(shù)為非定向固定化，易存在酶活性中心被破壞或阻擋、催化反應傳質(zhì)阻力過大、反應條件苛刻、酶易脫落等缺點。為此，通過生物信息學分析酶結(jié)構(gòu)，利用酶分子表面的供電子氨基酸與載體金屬螯合配體的配位作用力，針對性地設計了

2、一種酶定向固定化的方法，以期獲得具有高催化性能的固定化酶。本文以自制的金屬離子絡合磁性納米顆粒（AMNPs-ECH-IDA-Metal ions）為載體，定向固定化了來自家族1的β-葡萄糖苷酶（BGL），并研究了固定化酶的酶學性質(zhì)。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　(1) AMNPs-ECH-IDA-Metalions制備及其表征。通過化學共沉淀法制備磁性納米顆粒（MNPs），然后對MNPs進行金屬離子絡合功能化修飾。X射線衍射（XR

3、D）對MNPs表征證實MNPs為高純度Fe3O4反尖晶石型晶體，晶體平均粒徑為11nm；傅里葉紅外光譜（FT-IR）對AMNPs-ECH-IDA表征表明AMNPs-ECH-IDA成功包埋MNPs顆粒并且得到羧基化修飾；振動磁強計（VSM）對AMNPs-ECH-IDA-Co2+表征證實AMNPs-ECH-IDA-Co2+具有超順磁性，且擁有較高的飽和磁矩；能譜儀（EDS）圖譜證實 AMNPs-ECH-IDA-Co2+成功絡合鈷離子，掃描電

4、鏡（SEM）分析顯示制備的載體AMNPs-ECH-IDA-Co2+為單分散性較好、顆粒均勻、表面粗糙的球狀顆粒。
　　(2)通過生物信息學分析來自家族1的BGL結(jié)構(gòu)。獲得BGL酶分子的氨基酸組成及帶有各種活性基團的氨基酸殘基數(shù)目，運用CCP4MG蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析軟件進一步分析了BGL分子的三維構(gòu)象。結(jié)果顯示，BGL分子由兩個中心對稱的亞基構(gòu)成，亞基是由8個α/β構(gòu)成的“TIM桶狀結(jié)構(gòu)”，其中8個β折疊平行排列圍成“桶狀結(jié)構(gòu)”的內(nèi)壁，

5、8個α螺旋通過無規(guī)則卷曲與之相連，平行排列在β折疊外側(cè)。BGL的催化活性中心位于“桶狀結(jié)構(gòu)”內(nèi)壁的β折疊上，而底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于肽鏈C端。分析各種功能性氨基酸殘基在BGL分子中的含量及分布情況。結(jié)果顯示，咪唑基含量適中，且空間集中分布在遠離催化活性中心的α螺旋外表面。為此，選取組氨酸殘基作為固定化位點，通過組氨酸與 AMNPs-ECH-IDA-Co2+表面的鈷離子形成配位鍵達到定向固定化。通過此策略優(yōu)化制得的固定化BGL，蛋白比活為游離

6、BGL的117％，驗證了生物信息學分析結(jié)果。
　　(3)以AMNPs-ECH-IDA-Metalions為固定化載體，研究不同固定化條件下其對BGL的固定化效果。通過單因素優(yōu)化，以AMNPs-ECH-IDA-Co2+為載體得到最優(yōu)固定化條件為，在25℃，pH6.0的條件下固定化5小時，得到的固定化BGL的載體載酶量為1.81 mg/g載體，固定化酶蛋白比活力為641.7 U/g蛋白質(zhì)，固定化率為47.9％，固定化酶相對比活為117

7、％。
　　(4)固定化BGL和游離BGL的酶學性質(zhì)。對固定化BGL的催化反應動力學研究表明，固定化BGL催化水解pNPG的活化能為39.983 kJ/mol，相對于游離BGL降低了30.3％；固定化BGL和游離BGL的Km值分別為0.904 mmol/L和0.891 mmol/L，固定化BGL的Vmax與游離BGL的變化不大；固定化BGL的熱穩(wěn)定相對于游離BGL有顯著提升，在70℃處理90min后，游離BGL完全失活，而固定化BG