氫氣生物學效應系列研究.pdf

1、氫是自然界最簡單的元素，氫氣是無色、無嗅、無味、具有一定還原性的雙原子氣體。氫氣的溶解度比較低，且不能被機體大量吸收，所以，人們一直沒有重視氫在高等生物體內(nèi)的作用。在輻射化學領域，曾有人證明在溶液中氫氣可與羥自由基直接反應（Jphys Chem.1988），但這沒有受到生物學家重視?？茖W家曾試圖證明高壓情況下，氫氣或許可與氧或高活性自由基發(fā)生反應，但研究并沒有獲得該反應存在的直接證據(jù)（Undersea Hyperb Med. 1994）

2、。因此，大部分生物學家一直認為，氫氣屬于生理性惰性氣體。2007年國際上首次報道，動物呼吸2％的氫可有效治療腦缺血再灌注損傷。繼而，我們前期實驗研究率先發(fā)現(xiàn)，腹腔注射含氫鹽水也能非常有效治療新生大鼠缺血缺氧性腦損傷。雖然選擇性抗氧化是氫治療作用的可能機制，但在機體內(nèi)氫的具體作用機制尚不清楚，氫氣對其它缺血損傷是否具有類似的保護作用亦未知。因此，本課題先后采用3種不同的損傷模型（心肌缺血再灌注損傷，氧中毒肺損傷和一氧化碳遲發(fā)型腦損傷），尋

3、找氫氣選擇性抗氧化作用的在體依據(jù)及可能機制，從而為進一步深入研究氫氣治療缺血性疾病的內(nèi)在機制，開發(fā)利用氫作為臨床藥物，評價氫的生物學作用奠定基礎。
　　 目前，血管再通、恢復血流是治療急性心肌梗死（acute myocardiAlinfarction, AMI)臨床上最有效和普遍的手段。盡管恢復血流非常關鍵，呼吸爆發(fā)可以激發(fā)ROS的產(chǎn)生從而導致細胞毒作用。 活性氧的大量產(chǎn)生不可避免的驅(qū)動了細胞壞死和凋亡相關的信號通路的激活，此為

4、致死性再灌注損傷。50％以上的最終梗死面積歸因于再灌注損傷，因此減少再灌注損傷是保護心肌的一個重要靶點。本課題在于證實簡單易用、安全和經(jīng)濟的氫飽和生理鹽水對于心肌缺血再灌注損傷是否具有保護作用。我們通過評估注射氫飽和生理鹽水24小時后心肌梗死面積、氧化應激水平和心功能，對機制進行初步探討。
　　 氧中毒急性肺損傷（Hyperoxic acute lung injury, HALI）是由長時程的高濃度氧吸入引起（氧分壓超過50％）

5、。目前認為，高分壓氧引起活性氧增加，驅(qū)動氧化損傷是氧中毒的關鍵因素。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，氫是一種新的抗氧化物質(zhì)，可以有效減少氧化應激和炎癥反應。因此，本課題采用大鼠慢性氧中毒模型，氫飽和生理鹽水注射，肺臟損傷指標以及相關氧化指標和炎癥指標的測定，研究氫對氧中毒的影響，以期初步明確氫的作用機制，為防治氧中毒提供新的手段和實驗依據(jù)。
　　 一氧化碳（CO）中毒是目前困擾全球毒理學家、重癥監(jiān)護醫(yī)生、急癥醫(yī)生最常見的毒性氣體損傷導致的疾

6、病之一。CO中毒的臨床癥狀經(jīng)常是非特異性、多種多樣的。超過半數(shù)的存活者在CO中毒后的3天到4周內(nèi)會發(fā)生認知障礙。CO中毒的病理生理過程與低氧、興奮性氨基酸上升和氧化應激相關。中性粒細胞、線粒體和黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生的活性氧簇引起脂質(zhì)過氧化，最終導致遲發(fā)型神經(jīng)損傷的發(fā)生。本研究的目的旨在驗證氫氣治療減少CO遲發(fā)型腦病的推測，評估氫氣治療大鼠嚴重急性CO中毒腦病的有效性
　　 第一部分、氫飽和生理鹽水對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用<

7、br>　　 方法：
　　 1、采用大鼠冠狀動脈左前降支暫時阻斷30min，之后恢復冠狀動脈血供復灌注24 h的方法建立大鼠在體心肌缺血再灌注損傷模型。
　　 2、再灌注24 h后，經(jīng)右頸總動脈插入PE導管檢測大鼠左心室心功能參數(shù)。
　　 3、再灌注24 h后，1％TTC，37 oC, 心肌切片染色15 min并固定，檢測大鼠心肌梗死面積。
　　 4、蘇木精－伊紅染色（H&E）對心肌進行組織病理學評分。<

8、br>　　 5、取心肌缺血區(qū)組織勻漿標本和血漿標本，進行丙二醛（MDA）含量檢測，檢測心肌缺血區(qū)組織Caspase-3水平的表達。
　　 6、免疫組化檢測8羥基脫氧鳥嘌呤（8-OHdG）的表達和分布，TUNEL法檢測心肌細胞凋亡的情況。
　　 結果：
　　 1、與缺血再灌注組和缺血再灌注+生理鹽水注射組相比，再灌注5分鐘前單次腹腔注射氫飽和生理鹽水（5ml/Kg）可以明顯改善心肌缺血再灌注損傷引起的心功能下降

9、（P<0.05)。
　　 2、氫水治療可以明顯較少心肌梗死面積 （P<0.05),組織學分析顯示氫水治療組心肌缺血區(qū)細胞壞死和出血顯著減少，TUNEL染色顯示心肌細胞凋亡數(shù)減少。
　　 3、氫水治療組心肌缺血區(qū)組織和血漿中氧化損傷指標MDA明顯減少，凋亡酶Caspase-3在心肌缺血組織中表達亦減少 （P<0.05)。
　　 4、氫水治療可以降低再灌注損傷引起的DNA損傷指標8-OHdG的表達。
　　 第

10、二部分、氫飽和生理鹽水對氧中毒肺損傷的預防作用
　　 方法：
　　 1、建立大鼠慢性氧中毒模型（氧艙持續(xù)暴露60h，98％純氧吸入）
　　 2、檢測肺臟濕干比和胸膜腔滲出液含量，肺組織切片HE染色觀察肺臟形態(tài)學改變。
　　 3、檢測氧化應激指標MDA和SOD在肺臟組織勻漿中的表達。
　　 4、ELISA法檢測肺組織TNF-a、IL-1b、MPO和8-OHdG的表達。
　　 5、TUNEL染

11、色檢測肺臟細胞凋亡的變化。
　　 結果:
　　 1、氫氣可以有效預防氧中毒肺損傷，減少肺臟濕干比和胸膜腔滲出液，肺組織切片HE染色提示氫氣治療可明顯減少肺水腫、充血、肺泡內(nèi)出血，炎細胞浸潤。
　　 2、SOD、MDA和8-OHdG在氫氣治療組表達量均減少，提示氫氣治療可以有效減少氧化應激。
　　 3、氫氣治療可以有效減少肺臟中TNF-a、IL-1b和MPO的表達。
　　 4、TUNEL染色提示氫氣

12、治療組相比對照組和生理鹽水組肺泡上皮和內(nèi)皮細胞凋亡數(shù)量明顯減輕。
　　 第三部分、氫飽和生理鹽水對一氧化碳中毒遲發(fā)型腦病的治療作用
　　 方法：
　　 1、建立大鼠CO中毒模型，大鼠在動物艙內(nèi)持續(xù)40min吸入1000ppm濃度 CO，之后20min持續(xù)吸入3000ppm濃度CO至昏迷后出艙。
　　 2、CO中毒后9天，經(jīng)主動脈灌流4％多聚甲醛固定大鼠，取腦， 尼氏染色檢測皮層和海馬神經(jīng)元的形態(tài)學改變。<

13、br>　　 3、免疫熒光方法檢測腦中小膠質(zhì)細胞活化情況（Iba1的表達水平）,免疫組化檢測髓磷脂基礎蛋白 (MBP)在皮層和海馬中的表達。
　　 4、ELISA法檢測大腦組織TNF-a、IL-1b、MPO和8-OHdG的表達。
　　 5、Morris水迷宮檢測認知功能在不同處理組的差異。
　　 結果：
　　 1、與對照組相比，氫氣治療組皮層和海馬CA1區(qū)尼氏陽性細胞明顯減少。
　　 2、氫氣治療

14、可以有效減少CO中毒后腦中小膠質(zhì)細胞抗原Iba1的表達，同時氫氣治
　　 療組MBP降解亦減少。
　　 3、氫氣治療組大腦海馬和皮層中TNF-a、IL-1b、MPO和8-OHdG的表達相比對照組明顯降低。
　　 4、通過水迷宮檢測，提示氫氣治療可以明顯改善CO中毒導致的認識功能障礙。
　　 小 結
　　 1、氫飽和生理鹽水可以顯著提高大鼠缺血損傷后心功能的恢復。此種作用可能與氫氣的自由基清除作用有