海洋新型α-淀粉酶AmyP中Domain B區(qū)域的功能探索.pdf

1、α-淀粉酶廣泛的分布在動(dòng)物、植物和微生物中，是當(dāng)今工業(yè)化生產(chǎn)中不可或缺的酶制劑之一。在前期的工作中，本實(shí)驗(yàn)室從海洋宏基因文庫(kù)中篩選到了一個(gè)與已知的α-淀粉酶的序列相似性低于20％的新型α-淀粉酶AmyP（歸屬新的糖苷水解酶亞家族GH13_37）。其與GH13其他亞家族的α-淀粉酶進(jìn)行氨基酸序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)AmyP的Domain B區(qū)域片段大小（26個(gè)氨基酸構(gòu)成）僅為當(dāng)前報(bào)道的GH13其他亞家族α-淀粉酶的Domain B區(qū)域的20％左右，序

2、列太短，無(wú)法如常見的α-淀粉酶一樣形成典型的Domain B結(jié)構(gòu)，行使的功能與目前報(bào)道的功能也可能并不一樣。因此，對(duì)這個(gè)特殊的Domain B區(qū)域的研究能夠豐富人們對(duì)α-淀粉酶Domain B區(qū)域功能的認(rèn)識(shí)，同時(shí)也對(duì)深入了解α-淀粉酶AmyP的催化機(jī)制提供新的信息。
　　為了探索α-淀粉酶AmyP中DomainB區(qū)域的功能，我們首先設(shè)計(jì)了整段區(qū)域缺失突變和26個(gè)位點(diǎn)單點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)缺失突變后AmyP淀粉酶喪失酶活，表明雖然Dom

3、ain B區(qū)域很短但也是AmyP不可缺失的部分。歸納26個(gè)位點(diǎn)單點(diǎn)突變后檢測(cè)的酶學(xué)性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)突變體對(duì)不同底物的酶學(xué)活性都整體下降。進(jìn)一步檢測(cè)突變體的酶學(xué)動(dòng)力學(xué)常數(shù)（Km、kcat），發(fā)現(xiàn)突變降低了酶的酶學(xué)活性主要是因?yàn)橥蛔兘档土嗣傅拇呋磻?yīng)速率（kcat值明顯下降），但對(duì)酶的親和力影響并不明顯（Km值變化并不顯著）。
　　為了進(jìn)一步探索酶的催化反應(yīng)速率下降的原因，首先通過(guò)文獻(xiàn)分析發(fā)現(xiàn)Domain B區(qū)域的氨基酸可能是通過(guò)影響酶的整

4、體結(jié)構(gòu)從而降低酶的催化反應(yīng)速率。因此，設(shè)計(jì)了在野生型AmyP的激發(fā)光下檢測(cè)完全變性的野生型AmyP、Domain B區(qū)域缺失突變體、多點(diǎn)同時(shí)突變突變體（酶學(xué)活性下降幅度大的9個(gè)位點(diǎn)）、單點(diǎn)突變突變體（酶學(xué)活性下降幅度大的9個(gè)位點(diǎn)）的散射光值的熒光光譜實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)隨著對(duì)DomainB區(qū)域改變的減少，芳香族殘基所處的環(huán)境變化就越不明顯，酶的整體結(jié)構(gòu)變化也就越不明顯。因此，Domain B區(qū)域的氨基酸輕微的影響酶的整體結(jié)構(gòu)。
　　其次，通

5、過(guò)文獻(xiàn)分析也發(fā)現(xiàn)Domain B區(qū)域的氨基酸也可能影響酶的催化微環(huán)境（解離）從而降低酶的催化反應(yīng)速率。因此，設(shè)計(jì)了檢測(cè)突變體的最適 pH的實(shí)驗(yàn)（酶的電離發(fā)變化是通過(guò)酶的最適pH的變化展現(xiàn)出來(lái)），發(fā)現(xiàn)突變體的最適pH與野生型AmyP相比發(fā)生不同程度的堿性偏移，這表明突變體的酶活下降與酶的電離發(fā)生了變化有關(guān)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證DomainB區(qū)域的氨基酸變化確實(shí)影響了酶的電離，檢測(cè)了突變體與野生型AmyP的電離常數(shù)pKa值，發(fā)現(xiàn)與野生型AmyP相