G-四鏈體結(jié)構(gòu)表征在Pu39WT結(jié)構(gòu)推測中的應(yīng)用及其體外生物學功能初探.pdf

1、核酸是生命體內(nèi)重要的功能大分子之一，而脫氧核糖核酸(DNA)則作為遺傳密碼的載體承載著絕大多數(shù)生物物種的全部遺傳信息。除外生物體內(nèi)大多數(shù)DNA的存在形式——Watson Crick DNA右手雙螺旋結(jié)構(gòu)(B型DNA)之外，目前研究中已發(fā)現(xiàn)DNA還具有多種其他不同的二級結(jié)構(gòu)，包括右手螺旋(A型DNA)、左手螺旋（Z型DNA）、三聯(lián)體螺旋（H型DNA）、四聯(lián)體螺旋（G-四鏈體）、十字形結(jié)構(gòu)、發(fā)夾式結(jié)構(gòu)、和i-motif序列等。其中，G-四鏈

2、體是生物體內(nèi)富含鳥嘌呤殘基的核苷酸序列形成的一種特殊核酸二級結(jié)構(gòu)，這一結(jié)構(gòu)的形成對于真核細胞的端粒區(qū)和基因組區(qū)某些重大生物學過程具有重要影響，例如在啟動子中G-四鏈體的形成會影響其下游基因的復制與表達。由此探討DNA的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系具有十分重要的意義，可以加深對生命本質(zhì)的認識以及拓展DNA在各個領(lǐng)域的應(yīng)用，如針對G-四鏈體為治療靶點的抗腫瘤藥物的研究。
　　本課題主要運用圓二色譜儀，紫外分光光譜儀以及電泳儀等儀器研究了在不同離子

3、（鉀或鈉）環(huán)境下，不同富G序列形成的多種G-四鏈體結(jié)構(gòu)構(gòu)象，分析研究了不同G-四鏈體結(jié)構(gòu)構(gòu)象分別在CD光譜、TDS光譜、UV熱力學分析和電泳遷移中的表現(xiàn)特征;并應(yīng)用這些特征針對人Bcl-2基因P1啟動子上游的富G序列Pu39WT分別在鉀離子和鈉離子環(huán)境下形成的G-四鏈體結(jié)構(gòu)進行綜合分析，再加上通過對序列進行人工截短研究和文獻中的相關(guān)報道模擬出了Pu39WT全長序列在不同離子（K+或Na+）環(huán)境下可能形成的兩種(3+1)型G-四鏈體混合結(jié)

4、構(gòu)構(gòu)象。最后，我們在體外考察了Pu39WT全長序列及其人工截短序列與氯化血紅素結(jié)合形成DNA過氧化物酶后的催化氧化反應(yīng)的能力及活性，還在聚合酶鏈式反應(yīng)阻止實驗中考察了該組序列的結(jié)構(gòu)變化對PCR阻止效應(yīng)帶來不同程度影響的生物學表現(xiàn)。
　　研究結(jié)果表明:在不同離子（K+或Na+）環(huán)境下，富G核苷酸序列有形成不同結(jié)構(gòu)構(gòu)象的趨勢，并且G-四鏈體的不同構(gòu)象在上述方法學中的特征表現(xiàn)各有特點:1、在CD光譜中:平行G-四鏈體在波長240.0nm

5、和265.0nm左右處分別有特征負峰和正峰;反平行G-四鏈體在波長265.0nm和295.0nm左右處有特征負峰和正峰;平行與反平行共存或混合G-四鏈體在波長240.0nm和265.0nm左右處有特征負峰和正峰，并在波長295.0nm左右處有次正峰。2、在紫外融解曲線中:鉀離子比鈉離子環(huán)境中形成的G-四鏈體結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定（融解溫度值更高）;加熱對G-四鏈體的熱力學穩(wěn)定性有一定破壞作用;單分子結(jié)構(gòu)的G-四鏈體的熱力學參數(shù)值較大（絕對值小），雙

6、分子及多分子結(jié)構(gòu)的G-四鏈體的熱力學參數(shù)值較?。ń^對值大）。3、在紫外TDS圖譜中:平行G-四鏈體在波長240.0nm和273.0nm左右處有一特征正峰，同時在波長295.0nm左右處有一特征負峰，在波長260.00nm左右是兩峰之間存在清晰波谷;反平行G-四鏈體在波長273.0nm左右處有最高特征正峰，在波長240.0nm左右處有較小正峰，同時在波長295.0nm左右處有最低特征負峰，而在波長260.0nm處形成波峰波谷混合區(qū)帶;混合

7、G-四鏈體在波長273.0nm左右處有最高特征正峰，在波長240.0nm左右處有次高正峰，同時在波長295.0nm左右處有強度相當于273.0nm處的最低特征負峰，而在波長260.0nm處（240.0nm和273.0nm兩正峰之間）存在獨立清晰第三正峰。4、在非變性PAGE中:平行G-四鏈體多為多分子（四分子或更多）結(jié)構(gòu);反平行G-四鏈體多為單分子結(jié)構(gòu);混合G-四鏈體多數(shù)為單分子結(jié)構(gòu)，僅個別為雙分子結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)合上述結(jié)果對序列P

8、u39WT分別在鉀離子和鈉離子環(huán)境下進行結(jié)構(gòu)分析，根據(jù)其特征:1、在CD光譜中:在波長240.0nm和265.0nm左右處有特征負峰和正峰，并在波長295.0nm左右處有次正峰，為平行與反平行共存或混合G-四鏈體特征。2、在紫外融解曲線中:鉀離子比鈉離子環(huán)境中形成的G-四鏈體結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定（融解溫度值更高）;單分子G-四鏈體的熱力學參數(shù)值較大（絕對值?。?。3、在紫外TDS圖譜中:在波長273.0nm左右處有最高特征正峰，在波長240.0nm

9、左右處有次高正峰，同時在波長295.0nm左右處有強度相當于273.0nm處的最低特征負峰，而在波長260.0nm處（240.0nm和273.0nm兩正峰之間）存在獨立清晰第三正峰，亦說明為混合G-四鏈體。4、在非變性PAGE中:條帶為單分子結(jié)構(gòu)。綜合分析出Pu39WT為單分子的混合G-四鏈體結(jié)構(gòu)。而變異序列發(fā)生不同程度的變化，其中第2、5、7個G島的結(jié)構(gòu)組成性比較重要，由此模擬出了全長序列在不同離子（K+或Na+）環(huán)境下可能形成的兩種

10、(3+1)式含有三個G-四聯(lián)體平面的G-四鏈體二級結(jié)構(gòu)構(gòu)象。
　　最后，我們在體外進行的DNA過氧化物酶實驗證明了Bcl-2基因P1啟動子上游Pu39WT全長序列與氯化血紅素結(jié)合后能夠形成DNA過氧化物酶，并且其DNAzyme在鉀和鈉離子緩沖液中均表現(xiàn)出較強的DNA過氧化物酶活性，說明Pu39WT作為該酶的活性中心具有較強的核酶生物學活性，這種活性很可能與其G四鏈體結(jié)構(gòu)的形成緊密相關(guān)。而變異序列結(jié)合氯化血紅素形成的DNA過氧化物酶

11、作為對照大多數(shù)酶的活性均表現(xiàn)為下降，這很可能是由于Pu39WT序列發(fā)生變異后，DNA序列的變化造成酶活性中心的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變進而影響了其酶活功能的發(fā)揮，更加說明核酶的活性強弱與其序列及結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)。
　　通過以上實驗，我們得到了大量可靠的實驗數(shù)據(jù)和結(jié)論，這不但能為進一步利用G-四鏈體的結(jié)構(gòu)特征在富G序列結(jié)構(gòu)判斷中的應(yīng)用打下良好的基礎(chǔ)，還將對未來在基因啟動子中G-四鏈體的形成、結(jié)構(gòu)構(gòu)象與其生物學功能，以及G-四鏈體的結(jié)構(gòu)構(gòu)象與生物學