大黃、巴豆霜對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠藥效機(jī)制及有效物質(zhì)基礎(chǔ)的探討.pdf

1、目的：
　　潰瘍性結(jié)腸炎為慢性非特異性結(jié)腸炎癥，屬中醫(yī)“泄瀉”范疇，為現(xiàn)代難治性疾病之一。發(fā)病機(jī)制至今不明，全世界范圍內(nèi)逐年增長(zhǎng)的發(fā)病率使研究其病因及發(fā)病機(jī)制尤為重要。
　　中藥大黃、巴豆霜配伍作為止瀉對(duì)藥，廣泛應(yīng)用于急慢性腹瀉的治療。本實(shí)驗(yàn)前期研究表明，單品小劑量巴豆霜、巴豆霜與大黃按一定比例配伍具有明確止瀉功效。已有報(bào)道，包含大黃、巴豆霜配伍的中成藥對(duì)UC臨床治療效果明顯，但其配伍對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎作用機(jī)制尚鮮見(jiàn)報(bào)道，且大黃

2、、巴豆霜二者具有多成分、多靶點(diǎn)和多樣性的特點(diǎn)，作用機(jī)理及物質(zhì)基礎(chǔ)的闡明一直處于瓶頸狀態(tài)。
　　因此，本課題以TNBS/乙醇誘導(dǎo)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎及H2O2誘導(dǎo)IEC-6細(xì)胞凋亡模型，選擇巴豆霜乙醇粗提物、大黃組要成分大黃素、沒(méi)食子酸作研究對(duì)象，用以探討傳統(tǒng)藥對(duì)藥理作用機(jī)制及在潰瘍性結(jié)腸炎治療中作用，明確大黃、巴豆霜的有效物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.以 TNBS+乙醇灌腸誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型。
　　2.以前一

3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，從免疫學(xué)角度，探討潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制，研究大黃、巴豆霜治療作用。Wister雄性大鼠隨機(jī)分為模型組、大黃+巴豆霜配伍組、巴豆霜與大黃成分配伍組（巴豆霜+大黃素組、巴豆霜+沒(méi)食子酸組），正常對(duì)照組。造模后第4天，各治療組連續(xù)灌胃給藥7天，每日1次。11天處死大鼠，采集新鮮血、血清、結(jié)腸組織標(biāo)本。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠外周血CD4+CD25+Treg、CD4+CD25+Foxp3的變化；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定血清IL-6、IL-

4、10含量；免疫組織化學(xué)檢測(cè)腸粘膜ICAM-1、COX-2的表達(dá)情況。
　　3.在細(xì)胞水平上研究不同濃度巴豆霜乙醇粗提物、沒(méi)食子酸、大黃素在 H2O2誘導(dǎo)IEC-6細(xì)胞凋亡中的作用。血清饑餓的IEC-6細(xì)胞被分為不同處理組，空白對(duì)照組；200μmol/LH2O2處理組；不同濃度巴豆霜乙醇粗提物與沒(méi)食子酸、大黃素分別配伍預(yù)處理細(xì)胞后再以H2O2刺激組。MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳、TUNEL法及流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡。

5、Western blot檢測(cè)各組Caspase-3蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.清潔級(jí)環(huán)境條件下，成功建立潰瘍性結(jié)腸炎模型。TNBS100mg/kg+50％乙醇濃度大鼠第二天均出現(xiàn)腹瀉、血便、膿血便，腸粘膜充血、水腫，光鏡條件下，可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且死亡率低。
　　2.與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠外周血 CD4+CD25+Treg、CD4+CD25+Foxp3含量降低；細(xì)胞因子IL-6濃度升高，IL-10濃度

6、降低；粘膜ICAM-1、COX-2的表達(dá)升高（P<0.05）。大黃+巴豆霜配伍組、巴豆霜+沒(méi)食子酸組可升高大鼠外周血CD4+CD25+Treg、CD4+CD25+Foxp3的含量；IL-6濃度降低，IL-10濃度升高，ICAM-1、COX-2的表達(dá)明顯降低，差異具有顯著性（P<0.05）。而巴豆霜+大黃素配伍組和模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　3. MTT實(shí)驗(yàn)顯示：巴豆霜乙醇粗提物與沒(méi)食子酸、大黃素分別配伍明顯促進(jìn)細(xì)

7、胞增殖。DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳、TUNEL法及流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，經(jīng)藥物預(yù)處理一定濃度下可拮抗H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。巴豆霜乙醇粗提物與沒(méi)食子酸抑制細(xì)胞凋亡與Caspase-3活化有關(guān)；與大黃素配伍能抑制細(xì)胞的凋亡，與活化Caspase-3無(wú)關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1.清潔級(jí)環(huán)境條件下，TNBS+50%乙醇濃度為本實(shí)驗(yàn)造模的最佳濃度；SPF級(jí)環(huán)境由于缺乏致病微生物，大鼠損傷后很快修復(fù)，不適合本課題的實(shí)驗(yàn)研究。2.腸粘膜免疫異

8、常、細(xì)胞因子失衡參與UC發(fā)病。大黃、巴豆霜通過(guò)抑制腸粘膜局部免疫，促進(jìn)外周炎性因子平衡的恢復(fù)，發(fā)揮治療作用。巴豆霜+沒(méi)食子酸組達(dá)到相似治療效果，提示：沒(méi)食子酸可能為大黃和巴豆霜配伍發(fā)揮止瀉作用的有效物質(zhì)基礎(chǔ)。巴豆霜、大黃素亦可改善病理?yè)p傷，但免疫調(diào)節(jié)方面效果不明顯。
　　3.巴豆霜乙醇粗提物和沒(méi)食子酸、大黃素分別配伍可促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制凋亡。
　　綜上所述，大黃、巴豆霜通過(guò)抑制腸道局部炎癥，維持外周細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡，抑制細(xì)胞