市售鹿茸片、蜈蚣的DNA條形碼及蜈蚣特異性位點的研究.pdf

1、目的：確定鹿茸切片、蜈蚣適宜的DNA提取方法，考察DNA條形碼技術(shù)應用于市售鹿茸切片、蜈蚣藥材鑒別的可行性，以測得的線粒體COⅠ序列為基礎(chǔ)，探討特異性PCR技術(shù)鑒定蜈蚣藥材的可行性。
　　方法：1）采用全式金試劑盒、天根試劑盒、CTAB法對市售鹿茸切片和蜈蚣藥材進行DNA提取，通過核酸蛋白定量儀、電泳凝膠成像系統(tǒng)進行純度和濃度檢測，確定適宜的提取方法；2）用COⅠ通用引物對市售鹿茸切片、蜈蚣干品提取的DNA進行PCR擴增，觀察擴增

2、結(jié)果，并用TA克隆方法對鹿茸切片PCR擴增產(chǎn)物進行克隆純化，將鹿茸切片純化后的質(zhì)粒、菌液和蜈蚣PCR切膠回收的產(chǎn)物使用核酸測序儀ABI3730XL進行測序；3）將得到的序列在GenBank中進行相似檢索，下載需要序列，利用DNAMAN軟件、MEGA6.06分子進化遺傳分析等軟件對測序所得序列進行排序比對、計算GC含量，采用K-2p計算遺傳距離，用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹；4）在蜈蚣正品原動物及其混偽品原動物中藥材的COⅠ基因全序列分析的基礎(chǔ)

3、上，設(shè)計一對專用于鑒定蜈蚣干品藥材的位點特異性鑒別引物，用鑒別引物對樣品進行PCR擴增，觀察其陰陽性結(jié)果。
　　結(jié)果：1）經(jīng)過兩種試劑盒和CTAB法提取DNA基因組的比較，先使用天根試劑盒進行提取，發(fā)現(xiàn)提取的DNA純度較高，當天根試劑盒無法達到提取的濃度要求時便可采用CTAB法，而CTAB法提取的DNA濃度較高，為干品藥材的DNA提取提供了保障；2）線粒體COⅠ通用引物對市售鹿茸切片和蜈蚣提取的DNA基因組擴增良好，目的條帶明亮，

4、但隱約可見非目的性條帶存在；采用TA克隆方法的確可以彌補前期提取DNA純度不高的不足之處；鹿茸切片和蜈蚣COⅠ序列單一，幾乎無雜峰干擾，測序成功；3）在NCBI中進行BLAST后，可以初步確定采集的鹿茸切片樣品5號、8號、3-a為偽品，采集的蜈蚣干品藥材均為正品；根據(jù)系統(tǒng)聚類樹發(fā)現(xiàn)鹿茸切片樣品5號、8號樣本與馴鹿聚在一支，3-a樣本能夠單獨為一支，兩種正品藥材同屬聚在一起，個別物種又形成相對獨立的一支，支持率≧50，聚類樹的情況與BLA

5、ST結(jié)果一致；4）使用Primer軟件設(shè)計的針對蜈蚣COⅠ序列的特異性引物能夠?qū)⑹惺垓隍颊齻纹愤M行鑒別，根據(jù)PCR擴增凝膠電泳結(jié)果表明正品蜈蚣均出現(xiàn)了單一明亮條帶，而偽品蜈蚣則沒有明亮條帶。
　　結(jié)論：1）使用天根試劑盒和CTAB法進行鹿茸切片和蜈蚣干品的DNA提取是切實可行的，為同類市售藥材的DNA提取提供了方法參考依據(jù)；2）直接對市售鹿茸切片和蜈蚣干品使用COⅠ序列的DNA條形碼技術(shù)進行真?zhèn)舞b別是可行的，可以在市售動物藥材的鑒

6、別中進行推廣使用，為以往對動物藥材鑒定研究材料選擇上提供了新的選擇，節(jié)約了以往采集、保存、運輸基源動物組織或血液等材料的人力、物力、財力成本，凸顯了采用市售藥材為研究對象的便捷性、直觀性；使用TA克隆方法對PCR產(chǎn)物進行純化，可以彌補在DNA提取過程DNA純度不高的不足；3）使用該特異性引物 WG-F‘CGGTCCAGCATGAGTAATATTTGA’，WG-R‘AGGAAGTTTAATC GGAGATGAT’可以鑒別市售的蜈蚣藥材，提