簡介：點擊查看更多慢病毒載體介導(dǎo)hTERT對肝細胞生物學(xué)的影響.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：點擊查看更多重組腺病毒介導(dǎo)的Sox9基因轉(zhuǎn)染終板軟骨細胞生物學(xué)效應(yīng)的研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：目的骨植入體植入失敗是目前臨床亟待解決的問題。前期研究顯示鋅鈣摩爾比為05的鋅修飾硅酸鈣CA2ZNSI2O7陶瓷涂層比硅酸鈣CASIO3陶瓷涂層具有更好的促前成骨細胞粘附、增殖及分化的作用，并能與宿主骨界面形成有效的整合，揭示經(jīng)過ZN離子修飾的CASIO3陶瓷涂層對前成骨細胞生物學(xué)效應(yīng)產(chǎn)生重要作用。骨髓間充質(zhì)干細胞BMSCS作為體內(nèi)成骨細胞的主要分化來源，探索出對于BMSCS具有最理想生物學(xué)活性鋅鈣摩爾比的CAAZNSI2O7陶瓷涂層，并研究其浸提液對BMSCS的生物學(xué)影響及作用機制顯得尤為重要，為進一步探討其作為骨植入體涂層運用于大體實驗以及骨科和牙科臨床奠定實驗基礎(chǔ)。方法1BMSCS的提取、純化和鑒定。使用全骨髓貼壁法提取SD大鼠BMSCS，培養(yǎng)至第三代后，使用流式細胞術(shù)檢測CD29、CD90、CD45、CD31陽性率，進行成骨成脂誘導(dǎo)分化后，分別行茜素紅和油紅O染色后觀察分化情況，使用免疫熒光染色法進行VIMENTIN染色后觀察染色情況。2構(gòu)建并優(yōu)化CA2ZNSI2O7陶瓷涂層。采用溶膠凝膠法并調(diào)節(jié)鋅鈣離子的摩爾比，構(gòu)建鋅鈣摩爾比分別為01、03、05的CA2ZNSI2O7陶瓷粉體，然后使用大氣等離子噴涂系統(tǒng)APS進行噴涂，在特定參數(shù)下獲得CA2ZNSI2O7陶瓷涂層，檢測涂層表面形貌、化學(xué)穩(wěn)定性及與鈦基底材料的結(jié)合強度等。3觀察不同鋅鈣摩爾比的CA2ZNSI2O7陶瓷涂層對BMSC的生物學(xué)影響。檢測涂層浸提液中的鈣CA、硅SI、鋅ZN離子濃度。通過CCK8試劑盒檢測、倒置顯微鏡觀察BMSC在涂層材料表面及其浸提液中培養(yǎng)后的粘附、增殖情況通過ELISA方法檢測BMSCS在涂層材料表面及其浸提液中添加成骨誘導(dǎo)劑培養(yǎng)后ALP、BGP、COLⅠ的生成情況，茜素紅染色觀察鈣結(jié)節(jié)形成情況，ALP染色觀察ALP分泌情況。探索出促BMSCS生物學(xué)活性最優(yōu)的鋅鈣摩爾比CA2ZNSI2O7陶瓷。4TGFΒ1及IGF1所介導(dǎo)的TGFΒSMAD、MAPKERK及PKC信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究。使用最適鋅鈣摩爾比的CA2ZNSI2O7陶瓷涂層作為實驗組，BMSCS在含成骨誘導(dǎo)劑的各組浸提液中培養(yǎng)后，采用QRTPCR方法檢測成骨標記基因ALP、BGP、COLⅠ，TGFΒSMAD信號通路中TGFΒ1、SMAD2、SMAD3，以及MAPKERK、PKC信號通路中的IGFⅠ、ERK1、REK2、PKCΔ等關(guān)鍵基因MRNA的表達情況。探索TGFΒSMAD及MAPK及PKC信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在CA2ZNSI2O7陶瓷涂層對BMSCS生物學(xué)影響的作用。結(jié)果（一）使用全骨髓貼壁法成功傳代培養(yǎng)出了數(shù)量較多、細胞純度較高的SD大鼠BMSCS，具有良好的分化潛能。（二）成功制備了鋅鈣摩爾比為01、03、05的CA2ZNSI2O7陶瓷涂層，各組涂層的表面形貌均較為粗糙，與鈦基的結(jié)合強度均明顯強于CASIO3陶瓷涂層，三組之間未見明顯區(qū)別各組材料在DMEMF12培養(yǎng)液中浸泡1D后，CASIO3涂層釋放CA、SI離子濃度最高，而ZN離子濃度同普通培養(yǎng)基一致，CA2ZNSI2O7陶瓷涂層CA、SI離子濃度隨著鋅鈣摩爾比的增加而減少，同時ZN離子濃度隨之增加。（三）BMSCS在三組CA2ZNSI2O7陶瓷涂層表面及浸提液中粘附和增殖情況均顯著優(yōu)于未涂層鈦合金金屬片及CASIO3陶瓷涂層，其中鋅鈣摩爾比為03的CA2ZNSI2O7陶瓷涂層顯著優(yōu)于其余兩組在添加成骨誘導(dǎo)劑的條件下，BMSCS在三組CA2ZNSI2O7陶瓷涂層表面及浸提液中培養(yǎng)后，成骨分化及生成ALP、COLⅠ、BGP以及鈣結(jié)節(jié)形成情況均顯著優(yōu)于未涂層鈦片及CASIO3陶瓷涂層，其中鋅鈣摩爾比為03的CA2ZNSI2O7陶瓷涂層顯著優(yōu)于其余兩組。（四）BMSCS在各組含成骨誘導(dǎo)劑的浸提液中培養(yǎng)后，ALP、BGP、COLⅠMRNA的表達量以及TGFΒ1、SMAD2、SMAD3MRNA的表達量均隨時間變化而升高，鋅鈣摩爾比為03的CA2ZNSI2O7陶瓷涂層的表達量最高，CASIO3組次之。IGFⅠ、ERK1、ERK2、PKCΔMRNA的表達量隨時間延長而輕度升高，組間無明顯差異，21D時IGF1MRNA的表達量在鋅鈣摩爾比為03的CA2ZNSI2O7陶瓷涂層浸提液中顯著增多。結(jié)論不同鋅鈣摩爾比的CA2ZNSI2O7陶瓷涂層都具有粗糙的表面形貌、豐富的孔隙和生物活性的化學(xué)組分，并可釋放出的生物活性離子，無論是BMSCS在其表面直接培養(yǎng)，還是使用其浸提液進行培養(yǎng)，均表現(xiàn)出了相對于未涂層純鈦金屬片和CASIO3陶瓷涂層更為優(yōu)秀的促BMSCS粘附、增殖及成骨分化和礦化的能力。其中鋅鈣摩爾比為03的CA2ZNSI2O7陶瓷涂層對BMSCS的生物學(xué)影響最為積極。因此，該涂層對BMSCS擁有更加優(yōu)越的生物相容性和生物活性，顯著促進其粘附、增殖及成骨分化，所釋放出濃度適宜的ZN離子起了至關(guān)重要的作用，并且化學(xué)穩(wěn)定性好，與鈦基結(jié)合強度較高，再加上優(yōu)秀的抗菌性能，該材料作為新型的骨植入體材料擁有良好的前景。CA2ZNSI2O7陶瓷涂層促進BMSCS成骨分化的過程可能通過TGFΒSMAD信號通路傳導(dǎo)，而MAPKERK、PKC信號通路在BMSCS成骨過程中未被激活。IGFⅠ在BMSCS成骨分化晚期可能也起了作用。

簡介：小腸粘膜下層（SMALLINTESTINALSUBMUCOSA，SIS）是一種天然的細胞外基質(zhì)，主要成分是膠原蛋白。SIS經(jīng)加工后制成的修復(fù)材料具有良好的生物相容性、適當?shù)慕到庑?、低或無免疫原性、一定的機械強度等特性。目前，SIS修復(fù)材料廣泛用于血管、膀胱、腸道、肌腱以及泌尿系統(tǒng)等組織修復(fù)中。本研究所采用的脫細胞豬小腸粘膜下層疝修補片是由豬小腸粘膜下層經(jīng)脫細胞、凍干、滅菌等工藝制成，臨床上擬通過長期植入體內(nèi)修復(fù)疝氣、肛瘺等部位軟組織的損傷。本研究針對脫細胞豬小腸粘膜下層疝修補片生物學(xué)特性中的降解規(guī)律和免疫毒性兩方面進行臨床前研究，為其更安全、有效的應(yīng)用提供理論依據(jù)。（1）為了更加可靠地研究脫細胞豬小腸粘膜下層疝修補片的免疫毒性，本研究利用細菌脂多糖（LIPOPOLYSACIDE，LPS）優(yōu)化大鼠免疫刺激模型，為其免疫毒性研究設(shè)立免疫刺激組。選取WISTAR大鼠42只，隨機分為空白對照組、假手術(shù)組、免疫抑制組、LPS給藥后6H組、LPS給藥后12H組、LPS給藥后24H組和LPS給藥后48H組。對大鼠進行給藥處理后取材并檢測以下指標大鼠體重變化、免疫器官系數(shù)、血液學(xué)參數(shù)、T淋巴細胞亞群分析、淋巴細胞增殖、細胞因子（IL1Β和TNF?。┖?。結(jié)果顯示，LPS給藥后6H、12H組在免疫器官系數(shù)、血液學(xué)參數(shù)、T淋巴細胞亞群分析、淋巴細胞增殖、細胞因子含量方面均出現(xiàn)一定的免疫刺激現(xiàn)象，與空白對照組、假手術(shù)組比較存在顯著性差異（P（2）本研究對脫細胞豬小腸粘膜下層疝修補片的免疫毒性進行了探討。選取WISTAR大鼠80只，隨機分為高劑量組、低劑量組、假手術(shù)對照組、免疫抑制組和免疫刺激組，依據(jù)考察周期將每組16只大鼠再隨機分為1、4、8和12周4個實驗操作小組（N4）。對大鼠進行埋植給藥處理后取材并檢測以下指標大鼠體重變化、免疫器官系數(shù)、血液學(xué)參數(shù)、免疫器官病理學(xué)、NK細胞殺傷活性、T淋巴細胞亞群、淋巴細胞增殖、補體C3蛋白含量、免疫球蛋白（IGG、IGM）含量、細胞因子（IL1Β、IL6、TNF?。┖?。結(jié)果顯示，第1、4、8和12周的各時間點，高劑量組、低劑量組與假手術(shù)對照組在大鼠體重變化、血液學(xué)參數(shù)、免疫器官系數(shù)分析、免疫器官病理學(xué)分析、T淋巴細胞亞群分析、淋巴細胞增殖試驗、免疫球蛋白含量、細胞因子含量的測定方面變化趨勢基本一致，各組數(shù)據(jù)間相比不存在顯著性差異（P005）；高劑量組和低劑量組在NK細胞殺傷活性和補體C3含量測定方面與假手術(shù)對照組有一定差異。免疫刺激組大鼠在血液學(xué)參數(shù)、免疫器官系數(shù)分析、免疫器官病理學(xué)檢查、T淋巴細胞亞群分析、淋巴細胞增殖方面出現(xiàn)一定的免疫刺激現(xiàn)象，與高劑量組、低劑量組、假手術(shù)對照組比較有顯著性差異（P（3）本研究從體外降解和體內(nèi)降解兩方面對脫細胞豬小腸粘膜下層疝修補片的降解規(guī)律進行研究。體外降解包括加速降解和常規(guī)降解兩方面。其中加速降解是在05MGML的Ⅰ型膠原酶中震蕩進行，于不同時間點取出樣品碎片，計算其降解率。結(jié)果顯示，隨著時間的延長，脫細胞豬小腸粘膜疝修補片在05MGML的Ⅰ型膠原酶中逐漸降解，酶解20H降解率達到68％左右，此前的降解率均低于相同時間點下COOK疝修補片的降解率，此后二者降解率接近，至96H降解率均90以上。常規(guī)降解是在001MPBS中靜置進行，于不同時間點取出樣品碎片，計算其降解率。結(jié)果顯示，脫細胞豬小腸粘膜疝修補片靜置30D時幾乎未發(fā)生降解，此后隨著時間的延長，逐漸降解，至靜置180D時，降解率達到90以上。體內(nèi)降解的體內(nèi)埋植實驗跟免疫毒性研究的埋植實驗同步進行，分別于大鼠腹部皮下植入脫細胞豬小腸粘膜下層疝修補片后1周、4周、8周和12周對其進行埋植部位大體觀察和組織學(xué)觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，埋植部位大體觀察，隨著植入周期的延長，第1、4、8周的脫細胞豬小腸粘膜下層疝修補片不斷被結(jié)締組織包裹，并逐漸降解吸收，至植入12周脫細胞豬小腸粘膜下層疝修補片與周圍結(jié)締組織完全融合。組織學(xué)觀察，隨著植入周期的延長，第1、4、8周的脫細胞豬小腸粘膜下層疝修補片逐漸與周圍結(jié)締組織融合，炎癥細胞逐漸減少，至植入12周該材料與周圍結(jié)締組織基本融合，局部僅見少量散在炎癥細胞浸潤，未見明顯炎癥病變。大鼠皮下植入脫細胞豬小腸粘膜下層疝修補片12周時，皮下脫細胞豬小腸粘膜下層疝修補片基本完全降解。降解實驗結(jié)果說明，脫細胞豬小腸粘膜疝修補片具有適當?shù)纳锝到庑浴?

簡介：分類號R69密級單位代碼10312學(xué)號20131787南京醫(yī)科大掌碩士學(xué)位論文題目完成時間一一一三Q二盍生五月南京醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文目錄中文摘要1英文摘要3前言。5JLE文8材料和方法81實驗材料811質(zhì)粒和細胞812主要試劑813主要儀器92試驗方法921REALTIMEPCR檢測人前列腺正常上皮細胞RWPEL和人前列腺癌細胞LNCAP、DUL45及PC3細胞中MIR3633P的表達水平一9211細胞培養(yǎng)和MICFOIⅢA逆轉(zhuǎn)錄92，12MICRORNAREALTIIILEPCR反應(yīng)1022重組慢病毒MIR一3633P和MIR一3633PSPONGC質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定10221MIR一3633P片段的PCR擴增11222目的基因的獲取1L223MIR一3633P序列與載體的酶切、連接和轉(zhuǎn)化11224重組慢病毒MIR一3633PSPONGE質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定1223MIR3633P慢病毒的包裝及滴度測定1424穩(wěn)定表達細胞系的建立與鑒定14241穩(wěn)定表達細胞系的建立14242QRTPCR檢測MIR一3633P的水平152。5平板克隆實驗檢測細胞克隆增殖1526CCK8實驗檢測細胞增殖1527檢測細胞遷移侵襲能力15

簡介：分類號學(xué)號M201375494學(xué)校代碼10487密級碩士學(xué)位論文碩士學(xué)位論文長鏈非編碼RNAMEG3對人膀胱癌細胞生物學(xué)行為的作用及分子機制研究長鏈非編碼RNAMEG3對人膀胱癌細胞生物學(xué)行為的作用及分子機制研究學(xué)位申請人趙顯學(xué)科專業(yè)泌尿外科指導(dǎo)教師曾甫清教授蔣國松副教授答辯日期2016年5月

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簡介：目錄中文摘要（1）英文摘要（3）前言（5）材料方法（6）結(jié)果（16）討論（21）結(jié)論（22）參考文獻（23）文獻綜述（26）參考文獻（36）略縮詞表（41）攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文42個人簡歷43致謝44

簡介：剃刪∞量一嶧T蕈，I■■I單蝌啊R一鍾￡攀導(dǎo)TJI娃S髑泐≯袁案博壹學(xué)位落文⑧中史詫客建昂∥完懋漣粼遵傳易感鎣因及其瓣絨绱細艟生物擎亍強作用籪III；舅R‘一一22二_樊定論文趔菌’砘‰哪艚擎UE。啦母西兩IⅡQG麗西F薛率諸火姓巍；協(xié)燕攆“警教幫塑釜I窒蕉專業(yè)磺’克所茜名I揀J一跫壅量燮方向，一一。差童避塑一一一譬院一醴匿一諗J攥懿肅19J塑塑塑塹旦THESTUDYOFGENETICSUSCEPTIBILITYGENESOFCOMPLETEHYDATIDIFORMMOLEANDTHEBIOLOGICALFUNCTIONANDMECHANISMINCHORIOCARCINOMACELLS⑧AUTHOR’SSIGNATURESUPERVISORSSIGNATURE甚拿叢THESISREVIEWER1THESISREVIEWER2THESISREVIEWER3THESISREVIEWER4THESISREVIEWER5CHAIRPROFJUNLIN／WOMENSHOSPITALSCHOOLOFMEDICINEZHEIIANGUNIVERSIWCOMMITTEEOFORALDEFENCECOMMITTEEMAN1PROFYANLU／INSTITUTEOFTRANSLATIONALMEDICINEZHEIIA壁GUNIVERSITYCOMMITTEEMAN2PROFLINYULU／INSTITUTEOFTRANSLATIONALMEDICINEZHEIIAN2UNIVERSITYCOMMITTEEMAN3至Q￡Y璺壁G』望塾』玨壘墜G蘭塾壘望盟Q￡班墨衛(wèi)墜＆曼豎IXCOMMITTEEMAN4至￡Q￡圣塾I魚墜圣查璺望2￡旦曼墜EG魚Q堅星I豎里璧Q衛(wèi)L￡塾Q乜I壘LCOMMITTEEMAN5DATEOFORALDEFENEE5／24／2017

簡介：分類號UDC密級編號角方囂鐘六彥碩士學(xué)位論文HSL吣238對富頸癌細胞生物學(xué)行為的影響及其分子機制研究THEEFFECTOFHSPC238ONBIOLOGICALBEHAVIOROFCERVICALCELLANDITSMOLECULARMECHANISMSTUDY鐘裕恒導(dǎo)師姓名專業(yè)名稱培養(yǎng)類型論文提交日期囝田日墨疆盈盈學(xué)術(shù)型2017年5月碩士學(xué)位論文HSPC238對宮頸癌細胞生物學(xué)行為的影響及其分子機制研究碩士研究生鐘裕恒指導(dǎo)老師黃湘主任技師摘要目的一HSPC238，又名RNL81，RNFL81，是一種新型C3HC4型鋅指蛋白。鋅指蛋白是一類重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，是人類許多腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵所在。研究發(fā)現(xiàn)鋅指蛋白HSPC238的異常與肝癌、胃癌和大腸癌這些消化系統(tǒng)癌癥的發(fā)生有關(guān)，本課題擬探討HSPC238與宮頸腫瘤的關(guān)系，通過免疫組化實驗、EDU增殖實驗、TRANSWELL侵襲實驗、裸鼠成瘤實驗SDWESTERNBLOTTING實驗等研究HSPC238對宮頸癌細胞生長、增殖及侵襲等生物學(xué)行為的影響，并初步探討其發(fā)揮作用的分子機制，從而為揭示HSPC238的功能提供更多的信息和線索。方法1宮頸組織免疫組織化學(xué)檢測ABC法收集76例宮頸癌、105例宮頸上皮內(nèi)瘤變組織簡稱CIN及28例正常宮頸標本及臨床相關(guān)數(shù)據(jù)，然后用ABC法對標本行HSPC238免疫組織化學(xué)染色，統(tǒng)計比較其表達水平的差異，以及比較宮頸癌組織中HSPC238的表達水平在不同病理分級中的差異，肌層浸潤與否的差異，淋巴轉(zhuǎn)移與否的差異。2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和鑒定

簡介：ILLILILLHLLLLLLJLIJLLLLLLLFLTLLLLLLFIJY3268499分類號8ZI2密級壘玨單位代碼學(xué)號10159201110272碴幸回塞拜失孥博士學(xué)位論文中文題目長鏈非編碼LNAKCNQL0T在肺腺癌中的表達及其對肺腺癌A549細胞惡性生物學(xué)袁型和化療耐藥性的影響英文題目THEEXPRESSIONOF10NG13011CODINGRNAKCNQL0T1INLUNGADENOCARCINOMAANDITSINFLUENCETOMALIGNANCYANDCHEMORESISTANCEINA549CELLS論文作者指導(dǎo)教師學(xué)科專業(yè)完成時間壁亞塑石文君教授鹽盤堂2017年2月中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)位論文獨創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明本論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下獨立進行的研究工作及取得的研究成果，論文中除加以標注的內(nèi)容外，不包含其他人或機構(gòu)已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含本人為獲得其他學(xué)位而使用過的成果。對本研究提供貢獻的其他個人和集體均己在文中進行了明確的說明并表示謝意。本人完全意識到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。論文作者簽名印弄壚斗日期勘，年’6月S一日中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交學(xué)位論文的原件、復(fù)印件和電子版，允許學(xué)位論文被查閱和借閱。本人授權(quán)中國醫(yī)科大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編學(xué)位論文。保密，在年后解密適用本授權(quán)書。保密請在括號內(nèi)劃“√”敝儲攤修3日期山，7年F月R日指導(dǎo)教師簽名嗍加／7年翻J百

簡介：大面積皮膚嚴重?zé)齻木戎问悄壳柏酱鉀Q的醫(yī)學(xué)和社會問題。全國每年近千萬人的燒傷病人，近萬人嚴重?zé)齻?，其中約10％的嚴重?zé)齻∪擞捎谌狈ζぴ瓷袩o法挽救其性命。嚴重?zé)齻@救的病人由于無汗腺功能的疤痕組織取代皮膚使其終生喪失正常皮膚功能，嚴重影響病人的生活質(zhì)量。汗腺是人體皮膚組織中重要的功能性附屬器，汗腺可分為頂泌汗腺即大汗腺，和外泌汗腺即小汗腺。一般所說的汗腺是外泌汗腺，在調(diào)節(jié)體溫、分泌汗液及排出人體部分代謝廢物的過程中發(fā)揮重要的作用。外泌汗腺是單管狀腺，分為分泌部和導(dǎo)管部，分泌部位于真皮層或皮下組織內(nèi)，是盤曲成團的小管，而導(dǎo)管部開口于表皮層，連接分泌部和外界環(huán)境。汗腺的發(fā)育開始于胚胎時期1416周，至24周基本成熟，出生之后不會有新生的汗腺組織形成。皮膚組織修復(fù)和功能重建在國內(nèi)和國際上都是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的核心和熱點。輕度燒傷時，汗腺的導(dǎo)管處細胞可以其深部未受損的部分為模版從而重建汗腺被損壞的部分；但全層皮膚大面積深度燒傷時，由于汗腺組織被毀，則不能依賴細胞的分裂、增殖與終末分化來自我更新而重建其復(fù)雜結(jié)構(gòu)。至今尚無有效的方法體外擴增人汗腺細胞，對其生物學(xué)特性知之甚少。同時，干細胞可以定向分化為并構(gòu)建具有覆蓋保護能力的表皮層組織；也有研究表明干細胞可以定向分化為具有汗腺細胞表型的汗腺樣細胞，但是對于汗腺組織的功能性重建還未見報道，且干細胞分化為汗腺樣細胞的具體機制尚待探討。本研究皆在建立人外泌汗腺細胞體外分離和培養(yǎng)方法，并分析其生物學(xué)特性，在此基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建人汗腺細胞來源的IPS細胞，根據(jù)IPS細胞具有來源細胞的記憶性這一特性，開展汗腺細胞來源的IPS細胞分化為汗腺樣細胞的研究，探討其分化的關(guān)鍵分子機制，為其他類型干細胞分化為汗腺樣細胞提供理論基礎(chǔ)，使汗腺的功能性重建和功能性皮膚修復(fù)成為可能，提高大面積燒傷病人救治后的臨床療效，具有研究的創(chuàng)新性和潛在的應(yīng)用價值。第一部分人外泌汗腺細胞體外分離和培養(yǎng)及其生物學(xué)特性的鑒定。目的建立體外分離、提取、培養(yǎng)和純化人外泌汗腺細胞的方法，并對其生物學(xué)特性進行鑒定。方法將人皮膚樣本除去脂肪和結(jié)締組織，剪成1MM2的小塊，用分散酶于4℃消化18小時，第二天取出后用PBS漂洗。用鑷子將真皮層與表皮層輕輕分離，真皮層用剪刀剪碎，加入IV型膠原酶于37℃消化1小時，然后在倒置顯微鏡下使用移液槍將游離的汗腺組織吸出。在6CM的培養(yǎng)皿中先預(yù)先鋪一層鼠尾膠原，將汗腺貼于預(yù)鋪了膠原的6CM細胞培養(yǎng)皿中，一個小時后加入汗腺細胞培養(yǎng)基，于37℃、5CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。23D后，汗腺細胞從汗腺組織中長出。倒置顯微鏡觀察人外泌汗腺細胞形態(tài)；免疫組化方法對比不同部位來源皮膚汗腺數(shù)量的多少；透射電鏡觀察皮膚樣本汗腺細胞的細胞器結(jié)構(gòu)；PCR分析汗腺細胞胚胎干細胞標記和角質(zhì)化細胞標記；免疫熒光染色技術(shù)檢測體外培養(yǎng)的汗腺細胞的標志基因CEA和其他角蛋白K14、K8和K18的表達。結(jié)果（1）光學(xué)倒置顯微鏡下觀察人外泌汗腺，游離出來的汗腺組織可以觀察到盤曲成球的分泌部和較直的導(dǎo)管部；貼壁培養(yǎng)后可見汗腺上皮細胞從汗腺組織中生長出來，呈典型的上皮細胞樣，排列緊密，類似鋪石路狀，細胞邊界明顯，核清晰，具有一定的增殖能力；（2）免疫組化結(jié)果顯示，成人手掌部、成人頭頸部和成人胸腹部的皮膚處存在的汗腺數(shù)量較少，而手術(shù)切除的嬰幼兒多指樣本皮膚中存在有大量的汗腺；（3）透射電鏡結(jié)果顯示，皮膚中汗腺導(dǎo)管處由兩層細胞構(gòu)成，且存在有張力原纖維，汗腺腺體分泌部由兩類細胞構(gòu)成，分別是構(gòu)成管腔的細胞和肌上皮細胞；（4）PCR結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)的汗腺細胞，不表達胚胎干細胞的干性指標OCT4、SOX2和NANOG，表達增殖相關(guān)基因KLF4和CMYC，表達汗腺特異性指標CEA，表達上皮細胞指標K14、K8、K18和K19；（5）免疫熒光染色結(jié)果顯示，體外分離培養(yǎng)的人汗腺細胞表達汗腺特異性指標CEA，表達上皮細胞標記K14、K8和K18。結(jié)論成功從手術(shù)切除的嬰幼兒皮膚樣本中分離提取出大量的汗腺組織，滿足實驗研究的需要；體外分離培養(yǎng)的汗腺細胞具有一定的增殖能力，能傳代培養(yǎng)23代；對體外培養(yǎng)的汗腺細胞生物學(xué)特性進行鑒定，表達汗腺特異性指標CEA，表達上皮細胞標記K14、K8和K18具有上皮細胞的特性，為進一步研究汗腺細胞奠定基礎(chǔ)。第二部分人外泌汗腺細胞來源IPS細胞的構(gòu)建以及定向分化為汗腺樣細胞的研究目的構(gòu)建人外泌汗腺細胞來源的IPS細胞，并對其生物學(xué)特性進行鑒定；定向誘導(dǎo)人外泌汗腺細胞來源的IPS細胞分化為汗腺樣細胞，并對其生物學(xué)特性及功能性進行鑒定。方法取體外培養(yǎng)10天后的汗腺細胞，以1105個皿的密度接種于6CM細胞培養(yǎng)皿中，加入4種含有胚胎干細胞的轉(zhuǎn)錄因子基因OCT4、SOX2、KLF4和CMYC的慢病毒，24小時后移除含有慢病毒的培養(yǎng)基，PBS沖洗，加入新鮮的汗腺細胞完全培養(yǎng)基；23天后，消化細胞接種到鋪有滋養(yǎng)層細胞的6CM細胞培養(yǎng)皿中，更換胚胎干細胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)約10天后，挑選克隆和細胞形態(tài)與胚胎干細胞相似的克隆，接種于鋪有滋養(yǎng)層細胞的24孔板中。培養(yǎng)約10天后，再次挑選克隆和細胞形態(tài)與胚胎干細胞相似的克隆，接種于鋪有滋養(yǎng)層細胞的6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。光學(xué)顯微鏡觀察細胞形態(tài)；RTPCR，免疫熒光染色檢測誘導(dǎo)后的細胞生物學(xué)特性；細胞連續(xù)培養(yǎng)計數(shù)分析汗腺細胞來源IPS細胞的增殖能力；體外培養(yǎng)的人汗腺細胞經(jīng)過57天的培養(yǎng)，更換培養(yǎng)基為KGM2培養(yǎng)基，收集培養(yǎng)過人汗腺細胞的KGM2培養(yǎng)基，用022ΜM的濾器過濾，收集到的培養(yǎng)基為CM；取穩(wěn)定培養(yǎng)的人汗腺細胞來源IPS細胞，以2105個孔的密度接種于6孔板中，24小時后，待IPS細胞貼壁后，添加汗腺細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基（SGDM，汗腺細胞培養(yǎng)基CM11，額外添加50NGMLEGF）；然后每天更換培養(yǎng)汗腺細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基；待誘導(dǎo)后的細胞生長至匯合率為70，對細胞消化傳代，按1傳4的比例接種細胞至新的培養(yǎng)皿中，誘導(dǎo)分化21天后得到汗腺樣細胞；光學(xué)顯微鏡觀察其細胞形態(tài)；REALTIMEPCR分析其基因表達情況；流式細胞儀檢測汗腺相關(guān)蛋白表達；免疫熒光染色檢測汗腺相關(guān)蛋白表達；電鏡技術(shù)觀察細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)；3D組織培養(yǎng)方法檢測分化后的汗腺樣細胞形成汗腺樣結(jié)構(gòu)的能力，并對形成的汗腺樣結(jié)構(gòu)進行免疫熒光染色檢測。結(jié)果（1）光學(xué)顯微鏡下觀察構(gòu)建的人汗腺細胞來源IPS細胞，呈克隆樣生長，細胞邊界明顯，核質(zhì)比較高，有形成類胚體的能力，與人胚胎干細胞相似；（2）PCR結(jié)果表明人汗腺細胞來源IPS細胞表達胚胎干細胞指標OCT4、SOX2、KLF4、CMYC和NANONG，同時也表達汗腺相關(guān)指標K14和CD24；（3）免疫熒光染色結(jié)果顯示人汗腺細胞來源IPS細胞表達胚胎干細胞標志物OCT4、SOX2、NANOG、SSEA3、SSEA4、TRA160和TRA181；（4）細胞連續(xù)培養(yǎng)計數(shù)結(jié)果表明人汗腺細胞來源IPS細胞具有良好的增殖能力；（5）光學(xué)顯微鏡下觀察，由汗腺細胞來源IPS細胞誘導(dǎo)分化得到的汗腺樣細胞，細胞變大，成上皮細胞樣生長，核質(zhì)比變??；而人汗腺細胞，細胞較大，具有明顯的上皮細胞形態(tài)，呈鋪路石狀生長，細胞排列整齊。（6）REALTIMEPCR結(jié)果顯示，汗腺細胞來源IPS細胞在誘導(dǎo)的過程中，在MRNA水平上逐漸表達汗腺細胞指標EDA、EDAR、K8和CEA，且在分化的過程中逐漸接近汗腺細胞。（7）流式細胞儀技術(shù)檢測結(jié)果表明，誘導(dǎo)后的細胞表達汗腺相關(guān)指標EDA大約63，EDAR大約65，K8大約76，CEA大約56。（8）透射電鏡結(jié)果表明，誘導(dǎo)后得到的汗腺樣細胞具有人汗腺細胞有的微絨毛，而汗腺細胞來源IPS細胞則沒有微絨毛；（9）3D組織培養(yǎng)結(jié)果顯示，汗腺細胞來源IPS細胞誘導(dǎo)分化的汗腺樣細胞能夠在膠中形成汗腺管狀結(jié)構(gòu)，可見管狀結(jié)構(gòu)橫截面以及管腔，可觀察到誘導(dǎo)后的汗腺樣細胞在膠中形成管腔的過程，汗腺樣細胞在膠中增殖成團，中間的細胞逐漸凋亡，形成管腔；（10）免疫熒光染色的結(jié)果表明，汗腺細胞來源IPS細胞誘導(dǎo)分化的汗腺樣細胞在膠中形成的汗腺樣結(jié)構(gòu)表達部分汗腺相關(guān)基因。結(jié)論利用IPS技術(shù)成功構(gòu)建人汗腺細胞來源IPS細胞，并對其生物學(xué)特性進行了檢測分析，與人胚胎干細胞相似；定向誘導(dǎo)人汗腺細胞來源IPS細胞分化為汗腺樣細胞，光學(xué)顯微鏡、REALTIMEPCR、免疫熒光染色、透射電鏡及3D組織培養(yǎng)結(jié)果顯示，人汗腺細胞來源IPS細胞能分化為汗腺樣細胞，并且具有形成汗腺樣結(jié)構(gòu)的能力。第三部分干細胞汗腺分化機制的探討目的在建立使用條件培養(yǎng)基（CONDITIONMEDIA，CM）可誘導(dǎo)人汗腺來源IPS細胞分化為汗腺樣細胞的基礎(chǔ)上，分析CM中可能起關(guān)鍵作用的分子，為干細胞汗腺分化尋找合適的培養(yǎng)體系，為研究干細胞汗腺分化機制的研究提供理論依據(jù)。方法取2104的人汗腺來源IPS細胞（SGIPS）鋪于6孔板一孔中，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基（SGDM，汗腺細胞培養(yǎng)基CM11，額外添加50NGMLEGF），分別取誘導(dǎo)7天，14天和21天的樣本，利用REALTIMEPCR方法檢測分析不同分化時間點的汗腺樣細胞的基因表達情況；針對BMP4和HGF信號通路，利用REALTIMEPCR方法和免疫熒光染色的方法分析在分化過程中BMP4和HGF可能的來源，比較人汗腺細胞（SG）、人汗腺細胞培養(yǎng)中存在的成纖維細胞（SGFIB）以及SGFIB脫離SG環(huán)境培養(yǎng)2周的成纖維細胞（FIB）；WESTERNBLOT和ELISA檢測CM中HGF和BMP4的存在；在SGIPS分化到汗腺樣細胞的過程中，加入HGF和BMP4拮抗劑，分化21天后REALTIMEPCR方法檢測汗腺相關(guān)基因的表達；在SGIPS分化到汗腺樣細胞的過程中額外添加HGF和BMP4，分化21天后REALTIMEPCR方法檢測汗腺相關(guān)基因的表達；結(jié)果（1）REALTIMEPCR方法檢測結(jié)果顯示，汗腺相關(guān)基因EDA、EDAR和LEF1的表達在分化過程中呈上升趨勢，在第14天達到峰值，分化21天后表達水平接近正常汗腺細胞，說明EDA，EDAR和LEFT1在汗腺分化過程中發(fā)揮一定作用；進一步檢測其上游基因表達，包括MAPK通路和WNT通路中相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)ERK和ΒCATENIN的表達呈現(xiàn)相關(guān)性。BMP4，HGF，F(xiàn)GF10是胞外與MAPK和WNT通路有相關(guān)作用的分子，檢測其受體在細胞膜上的表達，發(fā)現(xiàn)BMP4受體BMPR1和BMPR2及HGF受體HGFR在分化過程中均有表達，而FGF10受體FGFR2則沒有表達；REALTIMEPCR方法檢測BMP4和HGF在分化過程中的來源結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在細胞中，BMP4主要由汗腺細胞來源的成纖維細胞分泌，汗腺細胞也有不同程度的分泌，而HGF則主要由汗腺來源的成纖維細胞分泌，免疫熒光染色的結(jié)果也證明了這一結(jié)果；在汗腺來源CM中，WESTERNBLOT和ELISA結(jié)果顯示HGF和BMP4均有存在，這說明在CM中存在對汗腺分化具有作用的HGF和BMP4；（2）在分化過程中加入BMP4和HGF拮抗劑后，汗腺相關(guān)基因EDA、EDAR、CEA和K8均有不同程度的下降，加入HGF拮抗劑的基因表達下降的比加入BMP4拮抗劑的明顯；在分化過程中額外加入BMP4和HGF重組蛋白取代CM中可能存在的未知分子，汗腺相關(guān)基因EDA、EDAR、CEA和K8表現(xiàn)出一定的相關(guān)性，但還不如汗腺誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)的效果明顯。結(jié)論由人汗腺細胞來源IPS細胞分化為汗腺樣細胞的過程中，從CM中尋找到兩個相關(guān)因子，HGF和BMP4在人汗腺來源IPS細胞分化為汗腺樣細胞中起關(guān)鍵作用，得出兩條可能的汗腺分化的作用途徑HGF和BMP4通路。HGF與細胞膜上的受體CMET結(jié)合，促進細胞基質(zhì)中ΒCATENIN表達上升，ΒCATENIN進入細胞核內(nèi)與LEF1作用，激活EDAEDAR信號通路，從而啟動汗腺分化；BMP4與細胞膜上的受體BMPR1和BMPR2結(jié)合，激活MAPK通路中的其中一條ERK通路，隨后ERK與細胞核中的LEF1作用激活EDAEDAR信號通路，從而啟動汗腺分化。綜上所述，本課題成功分離提取了人外泌汗腺，建立了體外培養(yǎng)人外泌汗腺細胞的方法，并用體外培養(yǎng)的人外泌汗腺細胞成功構(gòu)建的人汗腺細胞來源IPS細胞，對其生物學(xué)特性進行了鑒定，并在此基礎(chǔ)上定向誘導(dǎo)人汗腺細胞來源IPS細胞分化為汗腺樣細胞，對得到的汗腺樣細胞進行了生物學(xué)特性及功能性鑒定，在誘導(dǎo)分化的過程中尋找到了兩個可能的關(guān)鍵分子HGF和BMP4，建立了合適的干細胞汗腺分化培養(yǎng)體系，不僅為研究干細胞汗腺分化機制的研究提供有價值的理論依據(jù)，也為汗腺的功能性重建開拓新的途徑，具有潛在的應(yīng)用價值。

簡介：納米纖維能夠有效模仿細胞外基質(zhì)，提供適合的接觸引導(dǎo)來幫助神經(jīng)細胞分化和神經(jīng)突觸生長，因此成為神經(jīng)組織工程常用的生物材料。為在神經(jīng)組織工程中進一步應(yīng)用定向納米纖維，設(shè)計新的納米纖維材料表面，全面深入地闡釋定向納米纖維影響神經(jīng)細胞分化的分子機理，需要了解這個過程中所有基因、MRNA、蛋白質(zhì)、代謝物的差異表達以及組分相互間的關(guān)系。近年出現(xiàn)的高通量技術(shù)和系統(tǒng)生物學(xué)方法為從RNA、蛋白質(zhì)、代謝物等層次，全而系統(tǒng)地了解生物材料對細胞的影響和深入研究分子機理提供了強有力的技術(shù)方法支持。本論文的目的是綜合運用代謝組學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)方法，研究左旋聚乳酸定向不定向納米纖維對PC12細胞內(nèi)代謝物表達的影響，在代謝層次揭示旋聚乳酸定向不定向納米纖維對PC12細胞的影響。隨后與本課題組前期的研究結(jié)果（轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)）進行聯(lián)合分析，從系統(tǒng)生物學(xué)的角度闡釋PLLA定向納米纖維影響PC12細胞分化的機理。本論文的具體工作如下1、采用靜電紡絲法制備左旋聚乳酸PLLA定向不定向納米纖維，采用勻膠法制備PLLA薄膜。對三種材料進行了掃描電子顯微鏡SEM觀察。結(jié)果表明，PLLA薄膜表面比較平滑，PLLA定向不定向納米纖維粗細均一且無串珠，纖維直徑分別為27958±667NM和24502±793NM，定向納米纖維具有較好的取向性2、將預(yù)分化48H的PC12細胞分別種植在PLLA定向納米纖維（實驗組1，簡稱AF組）、PLLA不定向納米纖維（實驗組2，簡稱RF組）和PLLA薄膜（對照組，簡稱C組）上12H、24H和36H，搜集細胞樣本用于代謝組學(xué)實驗，一共六個實驗組AF組的三個間分別簡稱為A12、A24和A36，RF組的分別簡稱為R12、R24和R36，三個對照組（分別簡稱為C12、C24和C36），每組106～107個細胞樣本N53、采用基于液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的代謝組學(xué)研究手段，分別分析了PC12細胞種植在左旋聚乳酸的三種表面（定向納米纖維表面、不定向納米纖維表面和薄膜表面）12H、24H和36H后，細胞內(nèi)代謝物的表達進行相對定性分析，得到六個實驗組和三個對照組的代謝物表達譜峰圖。使用主成分分析法和最小二乘判別分析法結(jié)合T檢驗，篩選得到相對于對照組差異表達的代謝物，相對于C12組，A12組和R12組差異表達的代謝物數(shù)目分別為53種和54種，相對于C24組，A24組和R24組差異表達的代謝物數(shù)目分別為50種和47種，相對于C36組，A36組和R36組差異表達的代謝物數(shù)目分別為32種和42種4、采用生物信息學(xué)方法對差異表達代謝物進行了聚類分析和METPA分析，發(fā)現(xiàn)在PLLA定向和不定向納米纖維這兩種表面上培養(yǎng)了12H的細胞內(nèi)代謝物表達情況與培養(yǎng)了24H和36H的細胞內(nèi)代謝物表達情況差別較大，對AF組和RF組三個時間點均差異表達的代謝物進行通路分析，得到的通路中，AF組與RF組共有的通路苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，苯丙氨酸代謝，組氨酸代謝以及AF組有而RF組沒有的花生四烯酸代謝和牛磺酸，亞牛磺酸代謝通路與神經(jīng)細胞的分化相關(guān)5、對所得的代謝組學(xué)實驗數(shù)據(jù)和課題組前期得到的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)實驗數(shù)據(jù)進行聯(lián)合分析，得到種植在PLLA定向納米纖維表面的PC12細胞內(nèi)基因、蛋白質(zhì)和代謝物的差異表達引起的通路有11條，而PLLA不定向納米纖維表面的PC12細胞內(nèi)基因、蛋白質(zhì)和代謝物的差異表達引起的通路有7條。在這些通路中，AF組與RF組共有的通路酪氨酸通路和AF組有而RF組沒有的鞘脂類代謝和甘油磷脂代謝通路與分化相關(guān)，從氨基酸代謝和脂質(zhì)代謝兩個部分對PLLA影響PC12細胞的分化機理進行討論發(fā)現(xiàn)，基因LAO1的下調(diào)表達導(dǎo)致了苯丙氨酸的下調(diào)表達，加之與酪氨酸分解相關(guān)的蛋白質(zhì)GSTZ1上調(diào)表達，導(dǎo)致酪氨酸下調(diào)表達?；駻OC3上調(diào)表達與基因ALDH3A1下調(diào)表達的共同作用下，多巴胺上調(diào)表達。基因ALDH3A1的下調(diào)表達導(dǎo)致去甲變腎上腺素的上調(diào)表達。基因PLA2G4B上調(diào)表達導(dǎo)致磷脂酶的上調(diào)表達，促進了溶血磷脂和花生四烯酸的釋放，因此能夠分泌更多神經(jīng)遞質(zhì)。因此PLLA定向納米纖維表面的PC12細胞內(nèi)部，不利于神經(jīng)細胞分化的苯丙氨酸及其代謝物下調(diào)表達，有利于神經(jīng)細胞分化的花生四烯酸、多巴胺等上調(diào)表達，充分說明PLLA定向納米纖維有利于PC12細胞的分化。

簡介：第三軍醫(yī)大學(xué)研究生學(xué)位論文獨創(chuàng)性聲明秉承學(xué)校嚴謹?shù)男ｏL(fēng)和科研作風(fēng)，本人申明所呈交的論文是我本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得我?；蚱渌逃龣C構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料，與我同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均己在論文中作了明確的說明并表示謝意。申請學(xué)位論文與資料若有不實之處，本人承擔(dān)一切相關(guān)責(zé)任。論文作者簽名L雌日期J型必第三軍醫(yī)大學(xué)研究生學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本人完全了解第三軍醫(yī)大學(xué)有關(guān)保護知識產(chǎn)權(quán)的規(guī)定，即研究生在攻讀學(xué)位期間論文工作的知識產(chǎn)權(quán)單位屬第三軍醫(yī)大學(xué)。本人保證畢業(yè)離校后，發(fā)表論文或使用論文工作成果時署名單位為第三軍醫(yī)大學(xué)。學(xué)校有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。學(xué)?？梢怨紝W(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容保密內(nèi)容除外，可以采用影印、縮印或其他手段保存論文。論文作者簽名握生指導(dǎo)教師簽名么三毛日期≯匿；；L5第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文英文縮寫ESCCEAENCODEE2FRBCDKDDR1，一H2XPCREDNAGAPDHCHIPCCK8PBSPMSFSDSTBSDDH20TEMEDAPSDMSOPAGEPIMIRNAS3’UTRSIRNANC縮略語表英文全稱ESOPHAGEALSQUAMOUSCELLCARCINOMAESOPHAGEALADENOCARCINOMAENCYCLOPEDIAOFDNAELEMENTSE2一PROMOTERBINDINGFACTORRETINOBLASTOMACYCLINDEPENDENTKINASEDNADAMAGERESPONSEPHOSPHORYLATEDHISTONE2AXPOLYMERASECHAINREACTIONCOMPLIMENTAREOXYRIBONUCLEICACIDGLYCERALDEHYDE3PHOSPHATEDEHYDROGENASECHROMATINIMMUNOPRECIPITATIONCELLCOUNTINGKIT8PHOSPHATEBUFFEREDSALINEPHENYLMETHANESULFONYLFLUORIDEDODECYLSULFATESODIUMSALTTRISBUFFEREDSALINEDOUBLEDISTILLEDH20N，N，N’，NTETRAMETHYLETHYLENEDIAMINEAMMONIUMPERSULFATEDIMETHYLSULFOXIDEPOLYACRYLAMIDEGELELECTROPHRESISPROPIDIUMIODIDEMICRORNAS3’UNTRANSLATEDREGIONSMALLINTERFERINGRNANEGATIVECONTROL中文全稱食管鱗狀細胞癌食管腺癌DNA元素百科全書E2啟動子結(jié)合細胞因子視網(wǎng)膜母細胞瘤CYCLIN依賴激酶DNA損傷反應(yīng)磷酸化組蛋白2AX聚合酶鏈式反應(yīng)互補DNA甘油醛3磷酸脫氫酶染色質(zhì)免疫共沉淀細胞計數(shù)試劑盒8磷酸鹽緩沖液苯甲基磺酰氟十二烷基硫酸鈉三羥甲基氨基甲烷緩沖液雙蒸水N，N，N’，N’四甲基乙二胺過硫酸銨二甲基亞砜聚丙烯酰胺凝膠電泳碘化丙啶微小RNA3’非翻譯區(qū)小干擾RNA陰性對照

簡介：目的本課題通過多種實驗技術(shù)，研究燒傷創(chuàng)面修復(fù)過程中缺氧與細胞遷移的關(guān)系以及可能的機制。方法1原代角質(zhì)形成細胞的分離與培養(yǎng)2SIRNA轉(zhuǎn)染3腺病毒轉(zhuǎn)染4材料制作5加電處理細胞6活細胞工作站檢測單個細胞運動能力7劃痕實驗檢測細胞側(cè)向遷移能力8WESTERNBLOT9免疫熒光染色結(jié)果1電場通過下調(diào)PTEN激活MTC1而引起EMT，啟動細胞遷移。11外加直流電場處理可促進角質(zhì)形成細胞發(fā)生EMTWESTERNBLOT及免疫熒光染色顯示，外加直流電場處理可顯著增加SNAIL、SLUG、NCADHERIN、波形蛋白的表達水平，且這種促進作用呈時間依賴性，說明電場促進細胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)換。12外加直流電場處理引起細胞運動能力增加電場處理可明顯促進單個細胞運動距離及軌跡速度電場組細胞遷移面積大約是正常組2倍，說明電場可顯著增加促進單層細胞側(cè)向遷移。13外加直流電場處理抑制角質(zhì)形成細胞PTEN表達正常細胞中PTEN蛋白表達水平較高，電場可引起其表達下降，加電時間越長，PTEN含量下降越明顯。14外加直流電場通過下調(diào)PTEN引起EMT用SIRNA下調(diào)PTEN表達水平后，在相同的電場處理條件下，該組中SNAIL、SLUG、NCADHERIN、波形蛋白表達水平較單純加電細胞更高，ECADHERIN表達水平更低，說明降低電場處理時的PTEN水平可進一步促進EMT發(fā)生。用腺病毒過表達PTEN后，在相同的電場處理條件下，該組SNAIL、SLUG、NCADHERIN、波形蛋白表達水平顯著降低，ECADHERIN表達水平恢復(fù)，提示過表達PTEN可抑制EMT發(fā)生。15外加直流電場通過下調(diào)PTEN促進細胞運動性在相同的電場處理條件下，進一步下調(diào)PTEN后細胞運動范圍增加，平均運動距離及軌跡速度增大，過表達PTEN組細胞運動范圍縮小，平均運動距離及軌跡速度降低劃痕實驗結(jié)果一致。16外加直流電場可激活角質(zhì)形成細胞MTC1通路PP70S6K和P4EBP1的表達水平隨著電場處理時間的延長而逐漸增加，呈時間依賴性，說明電場處理可以激活MTC1通路。電場處理可激活MTC1，加入SIPTEN會進一步引起MTC1活化RAPAMYCIN可顯著抑制MTC1活性，但不影響PTEN的表達水平，說明PTEN可負向調(diào)控MTC1的活性。在相同的電場處理條件下，加入RAPAMYCIN會抑制SIPTEN對EMT的誘導(dǎo)，SNAIL、SLUG、NCADHERIN、波形蛋白表達水平下降，ECADHERIN表達水平恢復(fù)，說明PTEN下調(diào)誘導(dǎo)EMT時需要活化的MTC1。2電場通過激活自噬促進細胞定向遷移能力21外加直流電場處理促進角質(zhì)形成細胞定向遷移正常情況下，細胞隨機向各個方向運動，無明顯的方向性，運動范圍較小。電場處理使細胞從正極向負極移動，運動方向逐漸接近水平，細胞運動范圍明顯增大，說明外加直流電場處理可以促進細胞定向遷移。22外加直流電場處理可增加細胞自噬水平WESTERNBLOT結(jié)果表明，電場可引起HACAT和MKS細胞中自噬經(jīng)典標志物L(fēng)C3Ⅱ、P62表達增多，這種促進作用呈時間依賴性。電鏡結(jié)果顯示，正常情況下細胞中自噬水平很低，電場刺激后自噬數(shù)目增加，多為單層膜結(jié)構(gòu)，是已經(jīng)成熟的自噬溶酶體，胞漿成分已部分或全部降解。用GFPLC3腺病毒轉(zhuǎn)染細胞后加電處理，發(fā)現(xiàn)正常情況下細胞中自噬水平很低，綠色熒光無點狀聚集，加電后胞漿中出現(xiàn)大量點狀綠色熒光，即自噬體。該結(jié)果與前述結(jié)果一致，說明電場可增加細胞自噬水平。用針對LC3的抗體通過免疫熒光染色檢測細胞本身的內(nèi)源性蛋白，發(fā)現(xiàn)電場處理可以增加自噬水平。23電場條件下細胞自噬流通暢電場條件下，用ACTD處理細胞后，P62、LC3Ⅱ表達水平降至與正常細胞中P62、LC3Ⅱ表達量相等，說明加電時P62、LC3Ⅱ表達增高是由電場刺激基因轉(zhuǎn)錄、翻譯增加引起的。電場條件下，與單純加電組相比，CQ和BAFA1可引起P62、LC3Ⅱ水平顯著升高，說明加電時細胞自噬流通暢，抑制劑阻斷了降解過程的關(guān)鍵步驟，引起降解障礙，造成P62和LC3Ⅱ堆積。用GFPLC3腺病毒轉(zhuǎn)染細胞并加電，發(fā)現(xiàn)紅色熒光和綠色熒光完全重疊，形成嫩黃色，說明自噬體和溶酶體共定位好，提示二者融合無障礙，自噬流通暢。電鏡發(fā)現(xiàn)加電后細胞中自噬多為單層膜結(jié)構(gòu)，是已經(jīng)成熟的自噬溶酶體，胞漿成分已部分或全部降解。說明加電時自噬體和溶酶體融合成熟無障礙，融合后可順利降解底物，提示自噬流通暢。24敲除ATG5基因引起細胞自噬水平下降在正常情況下，用SIRNA敲減ATG5后，加電處理不再引起SIATG5細胞自噬水平增加，LC3下調(diào)，P62累積，說明敲除ATG5可抑制電刺激對自噬的促進作用。25電場條件下自噬促進角質(zhì)形成細胞定向遷移正常情況下，細胞向各個方向運動，無方向性，運動軌跡集中，運動范圍都比較小，電場處理可促進細胞定向遷移。與加電組相比，敲除ATG5的細胞加電后仍可定向遷移，但運動范圍減小，軌跡速度、位移速度、X軸方向位移速度顯著下降，說明外加直流電場處理通過自噬促進角質(zhì)形成細胞定向遷移能力。3缺氧通過抑制AMPK激活MTC1而促進細胞運動能力31缺氧處理激活角質(zhì)形成細胞中MTC1通路WESTERNBLOT結(jié)果顯示，MKS細胞缺氧3H、6H、12H后PP70S6K和P4EBP1表達水平均顯著上升，有統(tǒng)計學(xué)差異。P70S6K、4EBP1總蛋白表達水平不受缺氧處理的影響。HACAT細胞接受缺氧處理后亦出現(xiàn)類似的現(xiàn)象。正常情況下，PP70S6K主要分布在細胞核中，缺氧處理后熒光染色亮度增強，核中點狀陽性染色增加，P4EBP1染色得到相似的結(jié)果，說明缺氧處理激活角質(zhì)形成細胞中MTC1通路。32雷帕霉素處理抑制MTC1活性雷帕霉素可顯著抑制PP70S6K、P4EBP1表達量，與6H組有統(tǒng)計學(xué)差異，說明雷帕霉素可完全抑制缺氧激活的MTC1。33慢病毒干擾抑制MTC1活性敲減了RAPT的細胞接受缺氧處理后PP70S6K和P4EBP1表達量無明顯變化，P70S6K、4EBP1總蛋白表達水平不受缺氧及SHRAPT處理的影響，說明敲減RAPT可切實有效地抑制MTC1活性。34MTC1失活抑制細胞運動性活細胞工作站結(jié)果顯示，正常細胞的運動軌跡集中，軌跡速度較小，缺氧處理可促進細胞運動性。抑制MTC1活性后，細胞的運動范圍明顯減小，軌跡速度降低，單個角質(zhì)形成細胞的運動能力下降。劃痕實驗也可得到相似的結(jié)果。35缺氧處理抑制角質(zhì)形成細胞AMPK通路缺氧3H、6H、12H后PAMPK和PACC表達量顯著下降，AMPK、ACC總蛋白表達水平不受缺氧處理的影響。HACAT細胞接受缺氧處理后亦出現(xiàn)類似的現(xiàn)象。這些結(jié)果表明缺氧不影響AMPK的轉(zhuǎn)錄翻譯表達，可顯著抑制AMPK通路活性。36激活A(yù)MPK可抑制MTC1活性MET、AICAR處理可引起PAMPK、PACC表達水平明顯升高，AMPK通路激活，PP70S6K和P4EBP1表達量顯著下降，MTC1被明顯抑制，說明激活A(yù)MPK通路可抑制MTC1。在HACAT細胞中亦可得到一致結(jié)論。37激活A(yù)MPK可抑制細胞運動性活細胞工作站結(jié)果顯示，缺氧處理可促進細胞運動性，細胞的運動范圍、軌跡速度增加。加入MET和AICAR后，細胞的運動范圍減小，軌跡集中，軌跡速度降低。在HACAT細胞中亦可觀察到一致的現(xiàn)象，說明激活A(yù)MPK會引起單個角質(zhì)形成細胞的運動能力下降。劃痕實驗也可得到類似的結(jié)果。結(jié)論總結(jié)本課題，可得到以下結(jié)論1電場可引起角質(zhì)形成細胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)換，使細胞由靜止狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檫\動狀態(tài)，促進細胞運動能力這一過程是通過電場抑制PTEN從而激活MTC1信號通路實現(xiàn)的。2電場可引起角質(zhì)形成細胞從正極向負極定向遷移，遷移速度增加，這一過程是通過自噬實現(xiàn)的。電場可引起自噬生成增加，細胞中溶酶體酸化正常，自噬體和溶酶體順利融合，溶酶體可正常降解底物，自噬流通暢，不存在由于自噬流受損導(dǎo)致的自噬累積，下調(diào)細胞自噬水平不影響細胞運動的方向性，可顯著抑制細胞定向遷移速度。3缺氧可引起角質(zhì)形成細胞中細胞運動能力顯著增加，這一效應(yīng)的原因是缺氧引起AMPK活性下降從而激活MTC1通路。4本課題研究了創(chuàng)面微環(huán)境（電場、缺氧）對創(chuàng)面修復(fù)過程中角質(zhì)形成細胞啟動和后續(xù)遷移的作用及分子機制，對揭示創(chuàng)面愈合規(guī)律有重要理論價值，也為臨床創(chuàng)面治療提供新的思路。