創(chuàng)面生物電場和缺氧微環(huán)境對角質(zhì)形成細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及機(jī)制.pdf

1、目的：
　　本課題通過多種實驗技術(shù)，研究燒傷創(chuàng)面修復(fù)過程中缺氧與細(xì)胞遷移的關(guān)系以及可能的機(jī)制。
　　方法：
　　1.原代角質(zhì)形成細(xì)胞的分離與培養(yǎng)
　　2.siRNA轉(zhuǎn)染
　　3.腺病毒轉(zhuǎn)染
　　4.材料制作
　　5.加電處理細(xì)胞
　　6.活細(xì)胞工作站檢測單個細(xì)胞運動能力
　　7.劃痕實驗檢測細(xì)胞側(cè)向遷移能力
　　8.Western blot
　　9.免疫熒光染色
　

2、　結(jié)果：
　　1.電場通過下調(diào)PTEN激活mTORC1而引起EMT，啟動細(xì)胞遷移。
　　1.1 外加直流電場處理可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞發(fā)生EMT
　　Western Blot及免疫熒光染色顯示，外加直流電場處理可顯著增加Snail、Slug、N-cadherin、波形蛋白的表達(dá)水平，且這種促進(jìn)作用呈時間依賴性，說明電場促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)換。
　　1.2 外加直流電場處理引起細(xì)胞運動能力增加
　　電場處理可明顯

3、促進(jìn)單個細(xì)胞運動距離及軌跡速度;電場組細(xì)胞遷移面積大約是正常組2倍，說明電場可顯著增加促進(jìn)單層細(xì)胞側(cè)向遷移。
　　1.3 外加直流電場處理抑制角質(zhì)形成細(xì)胞PTEN表達(dá)
　　正常細(xì)胞中PTEN蛋白表達(dá)水平較高，電場可引起其表達(dá)下降，加電時間越長，PTEN含量下降越明顯。
　　1.4 外加直流電場通過下調(diào)PTEN引起EMT
　　用siRNA下調(diào)PTEN表達(dá)水平后，在相同的電場處理條件下，該組中Snail、Slug、N

4、-cadherin、波形蛋白表達(dá)水平較單純加電細(xì)胞更高，E-cadherin表達(dá)水平更低，說明降低電場處理時的PTEN水平可進(jìn)一步促進(jìn)EMT發(fā)生。用腺病毒過表達(dá)PTEN后，在相同的電場處理條件下，該組Snail、Slug、N-cadherin、波形蛋白表達(dá)水平顯著降低，E-cadherin表達(dá)水平恢復(fù)，提示過表達(dá)PTEN可抑制EMT發(fā)生。
　　1.5 外加直流電場通過下調(diào)PTEN促進(jìn)細(xì)胞運動性
　　在相同的電場處理條件下，進(jìn)

5、一步下調(diào)PTEN后細(xì)胞運動范圍增加，平均運動距離及軌跡速度增大，過表達(dá)PTEN組細(xì)胞運動范圍縮小，平均運動距離及軌跡速度降低;劃痕實驗結(jié)果一致。
　　1.6 外加直流電場可激活角質(zhì)形成細(xì)胞mTORC1通路
　　p-p70S6K和p-4E-BP1的表達(dá)水平隨著電場處理時間的延長而逐漸增加，呈時間依賴性，說明電場處理可以激活mTORC1通路。
　　電場處理可激活mTORC1，加入siPTEN會進(jìn)一步引起mTORC1活化;R

6、apamycin可顯著抑制mTORC1活性，但不影響PTEN的表達(dá)水平，說明PTEN可負(fù)向調(diào)控mTORC1的活性。
　　在相同的電場處理條件下，加入Rapamycin會抑制siPTEN對EMT的誘導(dǎo)，Snail、Slug、N-cadherin、波形蛋白表達(dá)水平下降，E-cadherin表達(dá)水平恢復(fù)，說明PTEN下調(diào)誘導(dǎo)EMT時需要活化的mTORC1。
　　2.電場通過激活自噬促進(jìn)細(xì)胞定向遷移能力
　　2.1 外加直流電

7、場處理促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞定向遷移
　　正常情況下，細(xì)胞隨機(jī)向各個方向運動，無明顯的方向性，運動范圍較小。電場處理使細(xì)胞從正極向負(fù)極移動，運動方向逐漸接近水平，細(xì)胞運動范圍明顯增大，說明外加直流電場處理可以促進(jìn)細(xì)胞定向遷移。
　　2.2 外加直流電場處理可增加細(xì)胞自噬水平
　　Western blot結(jié)果表明，電場可引起HaCaT和MKs細(xì)胞中自噬經(jīng)典標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ、p62表達(dá)增多，這種促進(jìn)作用呈時間依賴性。
　　

8、電鏡結(jié)果顯示，正常情況下細(xì)胞中自噬水平很低，電場刺激后自噬數(shù)目增加，多為單層膜結(jié)構(gòu)，是已經(jīng)成熟的自噬溶酶體，胞漿成分已部分或全部降解。
　　用GFP-LC3腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后加電處理，發(fā)現(xiàn)正常情況下細(xì)胞中自噬水平很低，綠色熒光無點狀聚集，加電后胞漿中出現(xiàn)大量點狀綠色熒光，即自噬體。該結(jié)果與前述結(jié)果一致，說明電場可增加細(xì)胞自噬水平。
　　用針對LC3的抗體通過免疫熒光染色檢測細(xì)胞本身的內(nèi)源性蛋白，發(fā)現(xiàn)電場處理可以增加自噬水平。<

9、br>　　2.3 電場條件下細(xì)胞自噬流通暢
　　電場條件下，用ACTD處理細(xì)胞后，p62、LC3-Ⅱ表達(dá)水平降至與正常細(xì)胞中p62、LC3-Ⅱ表達(dá)量相等，說明加電時p62、LC3-Ⅱ表達(dá)增高是由電場刺激基因轉(zhuǎn)錄、翻譯增加引起的。
　　電場條件下，與單純加電組相比，CQ和BafA1可引起p62、LC3-Ⅱ水平顯著升高，說明加電時細(xì)胞自噬流通暢，抑制劑阻斷了降解過程的關(guān)鍵步驟，引起降解障礙，造成p62和LC3-Ⅱ堆積。
　

10、　用GFP-LC3腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞并加電，發(fā)現(xiàn)紅色熒光和綠色熒光完全重疊，形成嫩黃色，說明自噬體和溶酶體共定位好，提示二者融合無障礙，自噬流通暢。
　　電鏡發(fā)現(xiàn)加電后細(xì)胞中自噬多為單層膜結(jié)構(gòu)，是已經(jīng)成熟的自噬溶酶體，胞漿成分已部分或全部降解。說明加電時自噬體和溶酶體融合成熟無障礙，融合后可順利降解底物，提示自噬流通暢。
　　2.4 敲除ATG5基因引起細(xì)胞自噬水平下降
　　在正常情況下，用siRNA敲減ATG5后，加電處

11、理不再引起siATG5細(xì)胞自噬水平增加，LC3下調(diào)，p62累積，說明敲除ATG5可抑制電刺激對自噬的促進(jìn)作用。
　　2.5 電場條件下自噬促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞定向遷移
　　正常情況下，細(xì)胞向各個方向運動，無方向性，運動軌跡集中，運動范圍都比較小，電場處理可促進(jìn)細(xì)胞定向遷移。與加電組相比，敲除ATG5的細(xì)胞加電后仍可定向遷移，但運動范圍減小，軌跡速度、位移速度、X軸方向位移速度顯著下降，說明外加直流電場處理通過自噬促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞

12、定向遷移能力。
　　3.缺氧通過抑制AMPK激活mTORC1而促進(jìn)細(xì)胞運動能力
　　3.1 缺氧處理激活角質(zhì)形成細(xì)胞中mTORC1通路
　　Western blot結(jié)果顯示，MKs細(xì)胞缺氧3h、6h、12h后p-p70S6K和p-4EBP1表達(dá)水平均顯著上升，有統(tǒng)計學(xué)差異。p70S6K、4EBP1總蛋白表達(dá)水平不受缺氧處理的影響。HaCaT細(xì)胞接受缺氧處理后亦出現(xiàn)類似的現(xiàn)象。
　　正常情況下，p-p70S6K主要

13、分布在細(xì)胞核中，缺氧處理后熒光染色亮度增強(qiáng)，核中點狀陽性染色增加，p-4EBP1染色得到相似的結(jié)果，說明缺氧處理激活角質(zhì)形成細(xì)胞中mTORC1通路。
　　3.2 雷帕霉素處理抑制mTORC1活性
　　雷帕霉素可顯著抑制p-p70S6K、p-4EBP1表達(dá)量，與6h組有統(tǒng)計學(xué)差異，說明雷帕霉素可完全抑制缺氧激活的mTORC1。
　　3.3 慢病毒干擾抑制mTORC1活性
　　敲減了Raptor的細(xì)胞接受缺氧處理后p

14、-p70S6K和p-4EBP1表達(dá)量無明顯變化，p70S6K、4EBP1總蛋白表達(dá)水平不受缺氧及shRaptor處理的影響，說明敲減Raptor可切實有效地抑制mTORC1活性。
　　3.4 mTORC1失活抑制細(xì)胞運動性
　　活細(xì)胞工作站結(jié)果顯示，正常細(xì)胞的運動軌跡集中，軌跡速度較小，缺氧處理可促進(jìn)細(xì)胞運動性。抑制mTORC1活性后，細(xì)胞的運動范圍明顯減小，軌跡速度降低，單個角質(zhì)形成細(xì)胞的運動能力下降。劃痕實驗也可得到相似

15、的結(jié)果。
　　3.5 缺氧處理抑制角質(zhì)形成細(xì)胞AMPK通路
　　缺氧3h、6h、12h后p-AMPK和p-ACC表達(dá)量顯著下降，AMPK、ACC總蛋白表達(dá)水平不受缺氧處理的影響。HaCaT細(xì)胞接受缺氧處理后亦出現(xiàn)類似的現(xiàn)象。這些結(jié)果表明缺氧不影響AMPK的轉(zhuǎn)錄翻譯表達(dá)，可顯著抑制AMPK通路活性。
　　3.6 激活A(yù)MPK可抑制mTORC1活性
　　Met、AICAR處理可引起p-AMPK、p-ACC表達(dá)水平明顯

16、升高，AMPK通路激活，p-p70S6K和p-4EBP1表達(dá)量顯著下降，mTORC1被明顯抑制，說明激活A(yù)MPK通路可抑制mTORC1。在HaCaT細(xì)胞中亦可得到一致結(jié)論。
　　3.7 激活A(yù)MPK可抑制細(xì)胞運動性
　　活細(xì)胞工作站結(jié)果顯示，缺氧處理可促進(jìn)細(xì)胞運動性，細(xì)胞的運動范圍、軌跡速度增加。加入Met和AICAR后，細(xì)胞的運動范圍減小，軌跡集中，軌跡速度降低。在HaCaT細(xì)胞中亦可觀察到一致的現(xiàn)象，說明激活A(yù)MPK會引

17、起單個角質(zhì)形成細(xì)胞的運動能力下降。劃痕實驗也可得到類似的結(jié)果。
　　結(jié)論：
　　總結(jié)本課題，可得到以下結(jié)論:
　　1.電場可引起角質(zhì)形成細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)換，使細(xì)胞由靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檫\動狀態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞運動能力;這一過程是通過電場抑制PTEN從而激活mTORC1信號通路實現(xiàn)的。
　　2.電場可引起角質(zhì)形成細(xì)胞從正極向負(fù)極定向遷移，遷移速度增加，這一過程是通過自噬實現(xiàn)的。電場可引起自噬生成增加，細(xì)胞中溶酶體酸化正常，自噬

18、體和溶酶體順利融合，溶酶體可正常降解底物，自噬流通暢，不存在由于自噬流受損導(dǎo)致的自噬累積，下調(diào)細(xì)胞自噬水平不影響細(xì)胞運動的方向性，可顯著抑制細(xì)胞定向遷移速度。
　　3.缺氧可引起角質(zhì)形成細(xì)胞中細(xì)胞運動能力顯著增加，這一效應(yīng)的原因是缺氧引起AMPK活性下降從而激活mTORC1通路。
　　4.本課題研究了創(chuàng)面微環(huán)境（電場、缺氧）對創(chuàng)面修復(fù)過程中角質(zhì)形成細(xì)胞啟動和后續(xù)遷移的作用及分子機(jī)制，對揭示創(chuàng)面愈合規(guī)律有重要理論價值，也為臨床