鈦納米管對鼠前成骨細(xì)胞生物學(xué)行為影響及作用機(jī)制.pdf

1、鈦由于具備優(yōu)良的機(jī)械和生物學(xué)性能已廣泛應(yīng)用于制作骨科與牙種植體，但由于其表面骨整合形成率較低，易引起種植體周圍炎，其遠(yuǎn)期愈后及穩(wěn)定性較差。如何能夠改善鈦種植體的組織相容性，使其具備一定的促成骨功能以加速骨整合目前已經(jīng)成為骨組織工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。對種植體材料表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)可為機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生積極應(yīng)答提供有利環(huán)境。二氧化鈦納米管陣列由于形態(tài)有序、管徑可控、具備較高表面親水性以及利于蛋白吸附等特征受到越來越多學(xué)者的關(guān)注。但針對不同管徑

2、大小對細(xì)胞成骨向分化等多種生物學(xué)行為的影響目前尚無定論。此外，細(xì)胞感受來源于材料表面結(jié)構(gòu)的機(jī)械刺激并產(chǎn)生生物應(yīng)答這一過程取決于細(xì)胞的粘附狀態(tài)，后者涉及到黏著斑激酶及細(xì)胞骨架調(diào)控蛋白相關(guān)機(jī)械信號傳導(dǎo)機(jī)制的激活，但關(guān)于該機(jī)制如何對細(xì)胞形態(tài)、增殖及分化進(jìn)行調(diào)控，其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及亞細(xì)胞水平變化等問題的研究尚不清晰。
　　目的：1.觀察不同管徑二氧化鈦納米管表面細(xì)胞的生物學(xué)行為變化；2.探討鈦納米管對細(xì)胞增殖能力的影響及其內(nèi)在機(jī)制；3.

3、探尋黏著斑激酶家族在納米管拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)促細(xì)胞成骨過程中的作用；4.考察FAK、RhoA和 YAP之間的相互關(guān)系及三者在細(xì)胞粘附及分化過程中所發(fā)揮的作用。方法：以陽極氧化法制備在鈦片及鈦種植體表面制備二氧化鈦納米管。1.掃描電鏡與原子力顯微鏡觀察其表面形貌及粗糙程度；分別在光滑面純鈦和不同管徑納米管材料表面培養(yǎng) MC3T3-E1細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡觀察黏著斑及細(xì)胞骨架形成情況；以5-溴脫氧尿嘧啶核苷法（BrdU）測定細(xì)胞增殖能力，Real-

4、time PCR檢測其成骨相關(guān)基因表達(dá)水平，能譜分析細(xì)胞基質(zhì)成分，Micro-CT掃描和組織切片染色考察表面修飾納米管的種植體在體內(nèi)促成骨效應(yīng)。2.流式細(xì)胞儀檢測不同材料表面細(xì)胞周期變化，免疫印跡（Western blot）考察胞內(nèi)黏著斑激酶（FAK）、細(xì)胞骨架調(diào)控蛋白（RhoA）表達(dá)水平，BrdU測定黏著斑激酶活性抑制劑、細(xì)胞骨架調(diào)控蛋白抑制劑C3及其效應(yīng)因子（Rock）抑制劑Y27632對細(xì)胞增殖能力的影響，非線性回歸分析評估各調(diào)控

5、蛋白表達(dá)水平與細(xì)胞增殖的相關(guān)關(guān)系。3. Western blot考察不同材料表面細(xì)胞PYK2及p-PYK2蛋白表達(dá)水平，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染建立FAK、PYK2及FAK+PYK2基因過表達(dá)模型，siRNA干擾建立FAK、PYK2及FAK+PYK2基因敲減模型，Real-time PCR檢測不同細(xì)胞模型的成骨相關(guān)基因表達(dá)水平。4. Image J軟件計(jì)算分析相同單位面積內(nèi)的細(xì)胞可粘附區(qū)域差異；激光共聚焦顯微鏡觀察YAP亞細(xì)胞分布；免疫共沉淀法考察細(xì)胞

6、黏著斑內(nèi) FAK募集水平差異；免疫 pull-down檢測 RhoA活性變化；免疫印跡法和熒光素酶測定法考察細(xì)胞核內(nèi)、外YAP表達(dá)差異；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染建立 YAP基因過表達(dá)細(xì)胞模型；Real-time PCR檢測RhoA活性增強(qiáng)、抑制，以及 YAP過表達(dá)對細(xì)胞成骨相關(guān)基因表達(dá)的影響。結(jié)果：不同電壓制備出的二氧化鈦納米管管徑分別為40nm（STNTs）和150nm（LTNTs）。1.與光滑面純鈦（Flat Ti）相比，STNTs和 LTNTs表

7、面細(xì)胞伸展面積均減?。?P<0.05），形態(tài)長寬比均增大（P<0.05），其中LTNTs變化最為顯著（P<0.05）；培養(yǎng)1天時(shí)LTNTs組細(xì)胞增殖水平明顯高于其他組（P<0.05），7天時(shí) STNTs和 LTNTs組均下降（P<0.05）。與Flat Ti相比，LTNTs和STNTs表面細(xì)胞分別在培養(yǎng)4天和21天時(shí)出現(xiàn)成骨相關(guān)基因表達(dá)水平升高（P<0.05），其中 LTNTs組升高最為顯著（P<0.05）；能譜分析結(jié)果顯示 LTNTs

8、和STNTs組細(xì)胞基質(zhì)中均出現(xiàn)鈣元素；Sprague-Dawley大鼠體內(nèi)植入14天時(shí)，大孔徑納米管修飾的種植體組周圍骨體積分?jǐn)?shù)和骨小梁數(shù)量均明顯高于光滑面種植體組（P<0.05）。2. LTNTs組細(xì)胞培養(yǎng)1天時(shí)處于S期的細(xì)胞所占比例高于另外兩組（P<0.05）；LTNTs和STNTs組細(xì)胞中FAK、p-FAK和RhoA表達(dá)水平均明顯低于Flat Ti組（P<0.05），且下降程度以LTNTs組最為顯著（P<0.05），但該組細(xì)胞的R

9、hoA/FAK相對蛋白水平較另外兩組顯著升高（P<0.05）；LTNTs組細(xì)胞在加藥黏著斑激酶抑制劑PF573228培養(yǎng)1天時(shí)增殖能力仍然最高（P<0.05），RhoA活性抑制劑 C3以及 C3+PF573228同時(shí)加藥后比例均顯著下降（P<0.05），Rock抑制劑Y27632加藥后增殖能力顯著低于Flat Ti組（P<0.05）；與MC3T3-E1細(xì)胞在不同材料表面增殖能力相關(guān)性最大的指標(biāo)為RhoA/FAK相對蛋白表達(dá)水平(P=0.

10、0017)。3. LTNTs組PYK2和p-PYK2表達(dá)較Flat Ti組和STNTs組顯著下降（P<0.05）；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染FAK、PYK2及FAK+PYK2過表達(dá)基因后，細(xì)胞內(nèi)FAK與PYK2蛋白表達(dá)水平較對照組明顯增高（P<0.05）；siRNA對 FAK、PYK2及FAK+PYK2進(jìn)行基因敲減后，細(xì)胞內(nèi)FAK與PYK2蛋白表達(dá)水平較對照組明顯減低（P<0.05）；LTNTs表面PYK2過表達(dá)細(xì)胞的成骨相關(guān)基因表達(dá)水平顯著低于對照組（

11、P<0.05）。4.三種材料表面的細(xì)胞可粘附區(qū)域的面積、黏著斑內(nèi)FAK募集水平、GTP-RhoA表達(dá)水平及YAP胞核內(nèi)表達(dá)量隨納米管管徑增加而遞減（P<0.05）；Flat Ti表面細(xì)胞充分伸展時(shí)，黏著斑及細(xì)胞骨架纖維數(shù)目多、分布廣，STNTs上細(xì)胞伸展面積縮小時(shí)黏著斑與細(xì)胞骨架纖維數(shù)目減少，僅在細(xì)胞周邊局部區(qū)域可見；LTNTs表面細(xì)胞周邊黏著斑與骨架纖維進(jìn)一步減少，僅分布于絲狀偽足凸起處；PF573228加藥后胞內(nèi)活性RhoA（GTP

12、-RhoA）表達(dá)量下降（P<0.05）；C3加藥后成骨相關(guān)基因表達(dá)明顯升高（P<0.05）；細(xì)胞在LTNTs表面過表達(dá)YAP或加入RhoA活性增強(qiáng)劑CN01后，胞核內(nèi)YAP分布增加，成骨相關(guān)基因表達(dá)明顯降低（P<0.05）。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成功制備出兩種孔徑的納米管；1.與Flat Ti相比，STNTs表面細(xì)胞面積減小，形態(tài)伸長，呈現(xiàn)一定的成骨向分化能力；LTNTs表面細(xì)胞伸展面積進(jìn)一步縮減，形態(tài)趨于梭形，細(xì)胞生長水平隨時(shí)間遞減，但在培養(yǎng)早

13、期具備較高的增殖能力，體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)其具備較高的促成骨效應(yīng)。2. LTNTs對細(xì)胞早期增殖有促進(jìn)作用，當(dāng)其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)抑制細(xì)胞內(nèi)FAK表達(dá)水平時(shí)，細(xì)胞骨架蛋白調(diào)控因子RhoA相關(guān)信號通路對其增殖能力的維持或促進(jìn)發(fā)揮重要影響作用。3. LTNTs表面細(xì)胞內(nèi)FAK及PYK2蛋白表達(dá)同時(shí)受到抑制，但PYK2的低水平表達(dá)對細(xì)胞成骨向分化有正向調(diào)控作用。4. LTNTs拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)為細(xì)胞提供的可粘附面積較Flat Ti和STNTs表面顯著減小，MC

14、3T3-E1細(xì)胞在其表面粘附面積受限，黏著斑內(nèi)FAK募集水平下降，黏著斑與細(xì)胞骨架形成障礙，RhoA活性減低，YAP亞細(xì)胞分布集中在細(xì)胞漿，細(xì)胞成骨向分化能力高，從亞細(xì)胞水平驗(yàn)證YAP作為FAK/RhoA機(jī)械傳導(dǎo)通路的下游信號因子對大孔徑納米管表面細(xì)胞形態(tài)改變及成骨向分化行為有重要調(diào)控作用。
　　本實(shí)驗(yàn)通過觀察不同納米管管徑對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，針對納米管表面細(xì)胞形態(tài)、增殖及分化的相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其相互之間的關(guān)系進(jìn)行研究，為篩