人外泌汗腺細胞的生物學(xué)特性及其iPS細胞向汗腺分化的研究.pdf

1、大面積皮膚嚴(yán)重?zé)齻木戎问悄壳柏酱鉀Q的醫(yī)學(xué)和社會問題。全國每年近千萬人的燒傷病人，近萬人嚴(yán)重?zé)齻?，其中約10％的嚴(yán)重?zé)齻∪擞捎谌狈ζぴ瓷袩o法挽救其性命。嚴(yán)重?zé)齻@救的病人由于無汗腺功能的疤痕組織取代皮膚使其終生喪失正常皮膚功能，嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量。
　　汗腺是人體皮膚組織中重要的功能性附屬器，汗腺可分為頂泌汗腺即大汗腺，和外泌汗腺即小汗腺。一般所說的汗腺是外泌汗腺，在調(diào)節(jié)體溫、分泌汗液及排出人體部分代謝廢物的過程中發(fā)揮重要

2、的作用。外泌汗腺是單管狀腺，分為分泌部和導(dǎo)管部，分泌部位于真皮層或皮下組織內(nèi)，是盤曲成團的小管，而導(dǎo)管部開口于表皮層，連接分泌部和外界環(huán)境。汗腺的發(fā)育開始于胚胎時期14-16周，至24周基本成熟，出生之后不會有新生的汗腺組織形成。
　　皮膚組織修復(fù)和功能重建在國內(nèi)和國際上都是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的核心和熱點。輕度燒傷時，汗腺的導(dǎo)管處細胞可以其深部未受損的部分為模版從而重建汗腺被損壞的部分；但全層皮膚大面積深度燒傷時，由于汗腺組織被毀，

3、則不能依賴細胞的分裂、增殖與終末分化來自我更新而重建其復(fù)雜結(jié)構(gòu)。至今尚無有效的方法體外擴增人汗腺細胞，對其生物學(xué)特性知之甚少。同時，干細胞可以定向分化為并構(gòu)建具有覆蓋保護能力的表皮層組織；也有研究表明干細胞可以定向分化為具有汗腺細胞表型的汗腺樣細胞，但是對于汗腺組織的功能性重建還未見報道，且干細胞分化為汗腺樣細胞的具體機制尚待探討。
　　本研究皆在建立人外泌汗腺細胞體外分離和培養(yǎng)方法，并分析其生物學(xué)特性，在此基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建人汗腺

4、細胞來源的iPS細胞，根據(jù)iPS細胞具有來源細胞的記憶性這一特性，開展汗腺細胞來源的iPS細胞分化為汗腺樣細胞的研究，探討其分化的關(guān)鍵分子機制，為其他類型干細胞分化為汗腺樣細胞提供理論基礎(chǔ)，使汗腺的功能性重建和功能性皮膚修復(fù)成為可能，提高大面積燒傷病人救治后的臨床療效，具有研究的創(chuàng)新性和潛在的應(yīng)用價值。
　　第一部分人外泌汗腺細胞體外分離和培養(yǎng)及其生物學(xué)特性的鑒定。
　　目的：
　　建立體外分離、提取、培養(yǎng)和純化人外泌

5、汗腺細胞的方法，并對其生物學(xué)特性進行鑒定。
　　方法：
　　將人皮膚樣本除去脂肪和結(jié)締組織，剪成1mm2的小塊，用分散酶于4℃消化18小時，第二天取出后用PBS漂洗。用鑷子將真皮層與表皮層輕輕分離，真皮層用剪刀剪碎，加入IV型膠原酶于37℃消化1小時，然后在倒置顯微鏡下使用移液槍將游離的汗腺組織吸出。在6cm的培養(yǎng)皿中先預(yù)先鋪一層鼠尾膠原，將汗腺貼于預(yù)鋪了膠原的6cm細胞培養(yǎng)皿中，一個小時后加入汗腺細胞培養(yǎng)基，于37℃、5%

6、CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3d后，汗腺細胞從汗腺組織中長出。倒置顯微鏡觀察人外泌汗腺細胞形態(tài)；免疫組化方法對比不同部位來源皮膚汗腺數(shù)量的多少；透射電鏡觀察皮膚樣本汗腺細胞的細胞器結(jié)構(gòu)；PCR分析汗腺細胞胚胎干細胞標(biāo)記和角質(zhì)化細胞標(biāo)記；免疫熒光染色技術(shù)檢測體外培養(yǎng)的汗腺細胞的標(biāo)志基因CEA和其他角蛋白K14、K8和K18的表達。
　　結(jié)果：
　?。?）光學(xué)倒置顯微鏡下觀察人外泌汗腺，游離出來的汗腺組織可以觀察到盤曲成球的分泌

7、部和較直的導(dǎo)管部；貼壁培養(yǎng)后可見汗腺上皮細胞從汗腺組織中生長出來，呈典型的上皮細胞樣，排列緊密，類似鋪石路狀，細胞邊界明顯，核清晰，具有一定的增殖能力；
　?。?）免疫組化結(jié)果顯示，成人手掌部、成人頭頸部和成人胸腹部的皮膚處存在的汗腺數(shù)量較少，而手術(shù)切除的嬰幼兒多指樣本皮膚中存在有大量的汗腺；
　?。?）透射電鏡結(jié)果顯示，皮膚中汗腺導(dǎo)管處由兩層細胞構(gòu)成，且存在有張力原纖維，汗腺腺體分泌部由兩類細胞構(gòu)成，分別是構(gòu)成管腔的細胞和

8、肌上皮細胞；
　?。?）PCR結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)的汗腺細胞，不表達胚胎干細胞的干性指標(biāo)Oct-4、Sox-2和Nanog，表達增殖相關(guān)基因Klf-4和c-Myc，表達汗腺特異性指標(biāo)CEA，表達上皮細胞指標(biāo)K14、K8、K18和K19；
　?。?）免疫熒光染色結(jié)果顯示，體外分離培養(yǎng)的人汗腺細胞表達汗腺特異性指標(biāo)C EA，表達上皮細胞標(biāo)記K14、K8和K18。
　　結(jié)論：
　　成功從手術(shù)切除的嬰幼兒皮膚樣本中分離提取

9、出大量的汗腺組織，滿足實驗研究的需要；體外分離培養(yǎng)的汗腺細胞具有一定的增殖能力，能傳代培養(yǎng)2~3代；對體外培養(yǎng)的汗腺細胞生物學(xué)特性進行鑒定，表達汗腺特異性指標(biāo)CEA，表達上皮細胞標(biāo)記K14、K8和K18,具有上皮細胞的特性，為進一步研究汗腺細胞奠定基礎(chǔ)。
　　第二部分人外泌汗腺細胞來源iPS細胞的構(gòu)建以及定向分化為汗腺樣細胞的研究
　　目的：
　　構(gòu)建人外泌汗腺細胞來源的iPS細胞，并對其生物學(xué)特性進行鑒定；定向誘導(dǎo)人

10、外泌汗腺細胞來源的iPS細胞分化為汗腺樣細胞，并對其生物學(xué)特性及功能性進行鑒定。
　　方法：
　　取體外培養(yǎng)10天后的汗腺細胞，以1×105個/皿的密度接種于6cm細胞培養(yǎng)皿中，加入4種含有胚胎干細胞的轉(zhuǎn)錄因子基因Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的慢病毒，24小時后移除含有慢病毒的培養(yǎng)基，PBS沖洗，加入新鮮的汗腺細胞完全培養(yǎng)基；2-3天后，消化細胞接種到鋪有滋養(yǎng)層細胞的6cm細胞培養(yǎng)皿中，更換胚胎干細胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)

11、約10天后，挑選克隆和細胞形態(tài)與胚胎干細胞相似的克隆，接種于鋪有滋養(yǎng)層細胞的24孔板中。培養(yǎng)約10天后，再次挑選克隆和細胞形態(tài)與胚胎干細胞相似的克隆，接種于鋪有滋養(yǎng)層細胞的6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。光學(xué)顯微鏡觀察細胞形態(tài)；RT-PCR，免疫熒光染色檢測誘導(dǎo)后的細胞生物學(xué)特性；細胞連續(xù)培養(yǎng)計數(shù)分析汗腺細胞來源iPS細胞的增殖能力；體外培養(yǎng)的人汗腺細胞經(jīng)過5-7天的培養(yǎng)，更換培養(yǎng)基為KGM2培養(yǎng)基，收集培養(yǎng)過人汗腺細胞的KGM2培養(yǎng)基，用0.22μ

12、m的濾器過濾，收集到的培養(yǎng)基為CM；取穩(wěn)定培養(yǎng)的人汗腺細胞來源iPS細胞，以2×105個/孔的密度接種于6孔板中，24小時后，待iPS細胞貼壁后，添加汗腺細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基（SGDM，汗腺細胞培養(yǎng)基：CM=1:1，額外添加50ng/ml EGF）；然后每天更換培養(yǎng)汗腺細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基；待誘導(dǎo)后的細胞生長至匯合率為70%，對細胞消化傳代，按1傳4的比例接種細胞至新的培養(yǎng)皿中，誘導(dǎo)分化21天后得到汗腺樣細胞；光學(xué)顯微鏡觀察其細胞形態(tài)； Realt

13、ime-PCR分析其基因表達情況；流式細胞儀檢測汗腺相關(guān)蛋白表達；免疫熒光染色檢測汗腺相關(guān)蛋白表達；電鏡技術(shù)觀察細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)；3D組織培養(yǎng)方法檢測分化后的汗腺樣細胞形成汗腺樣結(jié)構(gòu)的能力，并對形成的汗腺樣結(jié)構(gòu)進行免疫熒光染色檢測。
　　結(jié)果：
　?。?）光學(xué)顯微鏡下觀察構(gòu)建的人汗腺細胞來源iPS細胞，呈克隆樣生長，細胞邊界明顯，核質(zhì)比較高，有形成類胚體的能力，與人胚胎干細胞相似；
　?。?）PCR結(jié)果表明人汗腺細胞來源i

14、PS細胞表達胚胎干細胞指標(biāo)Oct4、Sox2、KLf4、c-Myc和Nanong，同時也表達汗腺相關(guān)指標(biāo)K14和CD24；
　?。?）免疫熒光染色結(jié)果顯示人汗腺細胞來源 iPS細胞表達胚胎干細胞標(biāo)志物Oct4、Sox2、Nanog、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81；
　?。?）細胞連續(xù)培養(yǎng)計數(shù)結(jié)果表明人汗腺細胞來源iPS細胞具有良好的增殖能力；
　?。?）光學(xué)顯微鏡下觀察，由汗腺細胞來源

15、iPS細胞誘導(dǎo)分化得到的汗腺樣細胞，細胞變大，成上皮細胞樣生長，核質(zhì)比變?。欢撕瓜偌毎毎^大，具有明顯的上皮細胞形態(tài)，呈鋪路石狀生長，細胞排列整齊。
　?。?）Realtime-PCR結(jié)果顯示，汗腺細胞來源 iPS細胞在誘導(dǎo)的過程中，在mRNA水平上逐漸表達汗腺細胞指標(biāo) EDA、EDAR、K8和CEA，且在分化的過程中逐漸接近汗腺細胞。
　　（7）流式細胞儀技術(shù)檢測結(jié)果表明，誘導(dǎo)后的細胞表達汗腺相關(guān)指標(biāo)EDA大約63%

16、，EDAR大約65%，K8大約76%，CEA大約56%。
　?。?）透射電鏡結(jié)果表明，誘導(dǎo)后得到的汗腺樣細胞具有人汗腺細胞有的微絨毛，而汗腺細胞來源iPS細胞則沒有微絨毛；
　?。?）3D組織培養(yǎng)結(jié)果顯示，汗腺細胞來源iPS細胞誘導(dǎo)分化的汗腺樣細胞能夠在膠中形成汗腺管狀結(jié)構(gòu)，可見管狀結(jié)構(gòu)橫截面以及管腔，可觀察到誘導(dǎo)后的汗腺樣細胞在膠中形成管腔的過程，汗腺樣細胞在膠中增殖成團，中間的細胞逐漸凋亡，形成管腔；
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17、免疫熒光染色的結(jié)果表明，汗腺細胞來源 iPS細胞誘導(dǎo)分化的汗腺樣細胞在膠中形成的汗腺樣結(jié)構(gòu)表達部分汗腺相關(guān)基因。
　　結(jié)論：
　　利用iPS技術(shù)成功構(gòu)建人汗腺細胞來源iPS細胞，并對其生物學(xué)特性進行了檢測分析，與人胚胎干細胞相似；定向誘導(dǎo)人汗腺細胞來源iPS細胞分化為汗腺樣細胞，光學(xué)顯微鏡、Realtime-PCR、免疫熒光染色、透射電鏡及3D組織培養(yǎng)結(jié)果顯示，人汗腺細胞來源iPS細胞能分化為汗腺樣細胞，并且具有形成汗腺樣結(jié)

18、構(gòu)的能力。
　　第三部分干細胞汗腺分化機制的探討
　　目的：
　　在建立使用條件培養(yǎng)基（Condition media，CM）可誘導(dǎo)人汗腺來源iPS細胞分化為汗腺樣細胞的基礎(chǔ)上，分析CM中可能起關(guān)鍵作用的分子，為干細胞汗腺分化尋找合適的培養(yǎng)體系，為研究干細胞汗腺分化機制的研究提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　取2×104的人汗腺來源iPS細胞（SG-iPS）鋪于6孔板一孔中，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基（SGDM，汗腺細胞

19、培養(yǎng)基：CM=1:1，額外添加50ng/ml EGF），分別取誘導(dǎo)7天，14天和21天的樣本，利用Realtime-PCR方法檢測分析不同分化時間點的汗腺樣細胞的基因表達情況；針對BMP4和HGF信號通路，利用Realtime-PCR方法和免疫熒光染色的方法分析在分化過程中BMP4和HGF可能的來源，比較人汗腺細胞（SG）、人汗腺細胞培養(yǎng)中存在的成纖維細胞（SG-Fib）以及SG-Fib脫離SG環(huán)境培養(yǎng)2周的成纖維細胞（Fib）；Wes

20、tern blot和ELISA檢測CM中HGF和BMP4的存在；在SG-iPS分化到汗腺樣細胞的過程中，加入HGF和BMP4拮抗劑，分化21天后Realtime-PCR方法檢測汗腺相關(guān)基因的表達；在SG-iPS分化到汗腺樣細胞的過程中額外添加HGF和BMP4，分化21天后Realtime-PCR方法檢測汗腺相關(guān)基因的表達；
　　結(jié)果：
　?。?）Realtime-PCR方法檢測結(jié)果顯示，汗腺相關(guān)基因EDA、EDAR和LEF1

21、的表達在分化過程中呈上升趨勢，在第14天達到峰值，分化21天后表達水平接近正常汗腺細胞，說明EDA，EDAR和Left1在汗腺分化過程中發(fā)揮一定作用；進一步檢測其上游基因表達，包括MAPK通路和Wnt通路中相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)ERK和β-catenin的表達呈現(xiàn)相關(guān)性。BMP4，HGF，F(xiàn)GF10是胞外與MAPK和Wnt通路有相關(guān)作用的分子，檢測其受體在細胞膜上的表達，發(fā)現(xiàn)BMP4受體BMPR1和BMPR2及HGF受體HGFR在分化過程中均有

22、表達，而 FGF10受體FGFR2則沒有表達；Realtime-PCR方法檢測BMP4和HGF在分化過程中的來源結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在細胞中，BMP4主要由汗腺細胞來源的成纖維細胞分泌，汗腺細胞也有不同程度的分泌，而H GF則主要由汗腺來源的成纖維細胞分泌，免疫熒光染色的結(jié)果也證明了這一結(jié)果；在汗腺來源CM中，Western blot和ELISA結(jié)果顯示HGF和BMP4均有存在，這說明在CM中存在對汗腺分化具有作用的HGF和BMP4；
　　

23、（2）在分化過程中加入BMP4和HGF拮抗劑后，汗腺相關(guān)基因EDA、EDAR、CEA和K8均有不同程度的下降，加入HGF拮抗劑的基因表達下降的比加入BMP4拮抗劑的明顯；在分化過程中額外加入BMP4和HGF重組蛋白取代CM中可能存在的未知分子，汗腺相關(guān)基因EDA、EDAR、CEA和K8表現(xiàn)出一定的相關(guān)性，但還不如汗腺誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)的效果明顯。
　　結(jié)論：
　　由人汗腺細胞來源iPS細胞分化為汗腺樣細胞的過程中，從CM中尋找到

24、兩個相關(guān)因子，HGF和BMP4在人汗腺來源iPS細胞分化為汗腺樣細胞中起關(guān)鍵作用，得出兩條可能的汗腺分化的作用途徑：HGF和BMP4通路。HGF與細胞膜上的受體c-Met結(jié)合，促進細胞基質(zhì)中β-cate nin表達上升，β-cate nin進入細胞核內(nèi)與Lef1作用，激活EDA/EDAR信號通路，從而啟動汗腺分化；BMP4與細胞膜上的受體BMPR1和BMPR2結(jié)合，激活MAPK通路中的其中一條ERK通路，隨后ERK與細胞核中的Lef1作

25、用激活EDA/EDAR信號通路，從而啟動汗腺分化。
　　綜上所述，本課題成功分離提取了人外泌汗腺，建立了體外培養(yǎng)人外泌汗腺細胞的方法，并用體外培養(yǎng)的人外泌汗腺細胞成功構(gòu)建的人汗腺細胞來源iPS細胞，對其生物學(xué)特性進行了鑒定，并在此基礎(chǔ)上定向誘導(dǎo)人汗腺細胞來源iPS細胞分化為汗腺樣細胞，對得到的汗腺樣細胞進行了生物學(xué)特性及功能性鑒定，在誘導(dǎo)分化的過程中尋找到了兩個可能的關(guān)鍵分子HGF和BMP4，建立了合適的干細胞汗腺分化培養(yǎng)體系，不