胚胎期人外泌汗腺的發(fā)生特征及細胞外基質誘導分化作用下外泌汗腺重建的研究.pdf

1、目的：
　　1.研究人胚胎皮膚不同發(fā)育時段外泌汗腺的形態(tài)結構分化特征以及相關標記性蛋白在外泌汗腺發(fā)生過程中表達特點及其與汗腺發(fā)生的內在聯(lián)系；
　　2.探索和評估細胞外基質在體環(huán)境下誘導外泌汗腺細胞三維重建的汗腺樣組織與正常成人外泌汗腺在形態(tài)、結構、功能上的相似性。
　　方法：
　　1.根據(jù)相關人外泌汗腺特異性蛋白在成人外泌汗腺不同部位差異性表達特點，將CK8、CK18、CK7、CK15設計為外泌汗腺分泌部標記角蛋

2、白；將CK5、CK14、CK19作為外泌汗腺導管部標記角蛋白；-SMA作為肌上皮細胞特異性表達蛋白。將上述目的角蛋白按CK8/CK5、CK18/CK14、CK7/CK14、CK19/CK15、CK5/SMA分組，采用免疫雙熒光化學染色方法檢測不同妊娠周期人胚胎皮膚中上述外泌汗腺特標志蛋白表達及定位情況，并觀察汗腺形態(tài)結構發(fā)生特點；
　　2.收集原代培養(yǎng)融合達70％的人外泌汗腺細胞、人成纖維細胞，按照（matrigel基質包埋外泌汗

3、腺細胞體內培養(yǎng)組，I型膠原纖維包埋外泌汗腺細胞體內培養(yǎng)組，matrigel基質包埋人成纖維細胞體內培養(yǎng)組）分組將上述兩種細胞按適當比例與matrigel基質、I型膠原分別混合后移植于免疫缺陷裸鼠NuNu腹股溝皮下。將上述三組在體三維培養(yǎng)2周后膠栓取出后，常規(guī)甲醛固定后石蠟包埋、切片，采用HE染色、免疫熒光化學染色、基底膜六胺銀染色方法并與正常成人皮膚外泌汗腺在形態(tài)結構、功能蛋白、結構蛋白表達方面進行鑒別分析。
　　結果：
　

4、　1.CK14、CK15、CK5在早期的胚胎表皮基底細胞中既已存在，在發(fā)育早期隨表皮干細胞向外泌汗腺定向分化過程中持續(xù)表達，在汗腺發(fā)育中期隨汗腺結構分化趨于成熟在汗腺導管部或分泌部選擇性失表達。CK7、CK19、α-SMA在汗腺形成早期不表達，在汗腺功能結構分化趨于成熟的階段特異性選擇性表達于汗腺特定部位。CK8、CK18未在胚胎皮膚汗腺中檢測到，但正常成人外泌汗腺分泌細胞中表達。
　　2.matrigel基質包埋外泌汗腺細胞體內

5、培養(yǎng)組形成腺管樣結構的組織，表達和免疫定位與成人外泌汗腺相同的基底膜，汗腺標志蛋白（P-CK、CK5、CK7、CK14、CK19、CEA、α-SMA），緊密連接蛋白（Desmoglein-1/2、ZO-2、E-cadherin、Claudin-1），以及與汗液分泌和重吸收相關的功能蛋白（Na+-K+-ATPaseα/β、AQP5、CFTR、NKCCl、NHE1、V-ATPase、γENaC）。
　　結論：
　　1.汗腺的發(fā)生

6、與表皮干細胞在胚胎發(fā)育期定向分化密切相關。汗腺形成中期（胚胎妊娠17-22周）為汗腺形態(tài)結構及功能快速形成時期。汗腺發(fā)生過程伴隨著中間絲相關角蛋白程序性、規(guī)律性表達，相關角蛋白對汗腺組織結構形成及功能維持具有特殊的意義。
　　2.裸鼠體內matrigel基質可以成功誘導汗腺細胞分化形成類外泌汗腺的腺管樣結構。新生腺管樣結構表達汗腺標志蛋白、緊密連接蛋白、錨定蛋白、以及與汗液分泌和重吸收相關的功能蛋白，這與正常成人外泌汗腺極其相似。