非外源性基因干擾誘導(dǎo)表皮細(xì)胞去分化及再生汗腺的臨床研究.pdf

1、目的： 1.體內(nèi)和體外建立表皮細(xì)胞去分化模型，檢測(cè)與去分化有關(guān)的信號(hào)通路，確定調(diào)控該過(guò)程的關(guān)鍵蛋白，為進(jìn)一步探明表皮細(xì)胞去分化發(fā)生機(jī)制提供理論基礎(chǔ)； 2.體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向汗腺細(xì)胞分化，并利用干細(xì)胞移植技術(shù)促進(jìn)體內(nèi)損傷汗腺的修復(fù)與再生。 方法： 1.將去除基底干細(xì)胞層的人表皮片移植到全層皮膚切割傷BALB/c裸鼠皮下，分別于移植后3d、5d和7d取出移植皮片，采用免疫組織化學(xué)法、流式細(xì)胞檢測(cè)、We

2、stern bloting和RT-PCR法檢測(cè)移植皮片表型的改變。同樣方法處理瘢痕皮片和角膜上皮，通過(guò)免疫組織化學(xué)染色觀察二者表型的改變。 2.離體條件下選擇熱和bFGF作為誘導(dǎo)因素處理成熟表皮細(xì)胞。采用細(xì)胞化學(xué)染色、流式細(xì)胞檢測(cè)和Western bloting觀察細(xì)胞表型的改變；通過(guò)Giemsa染色和電鏡檢測(cè)觀察細(xì)胞形態(tài)的改變；通過(guò)二維和滋養(yǎng)層培養(yǎng)體系觀察細(xì)胞的增殖能力，包括克隆形成和復(fù)層生長(zhǎng)情況；采用器官培養(yǎng)體系體外構(gòu)建三維

3、皮膚觀察細(xì)胞再分化形成表皮情況；應(yīng)用基因芯片技術(shù)觀察細(xì)胞基因表達(dá)的改變。用β-粘連蛋白(β-catenin)激動(dòng)劑處理細(xì)胞觀察細(xì)胞表型和增殖能力的改變；通過(guò)siRNA抑制β-catenin的表達(dá)觀察其對(duì)表皮細(xì)胞去分化過(guò)程的影響；利用Smad4敲除小鼠間接激活表皮細(xì)胞β-catenin，并觀察CK14和Ki67在表皮組織內(nèi)的表達(dá)情況。 3.體外分離、培養(yǎng)和鑒定人成體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)和人汗腺細(xì)胞(SGCs)；分別用Brd

4、U或綠色熒光蛋白(green fluorescence protein，GFP)標(biāo)記MSCs；將融合的SGCs經(jīng)47℃高溫處理造成體外熱損傷休克模型，再加入標(biāo)記的MSCs共同培養(yǎng)，5d后，檢測(cè)MSCs表型的改變；將具有汗腺表型的干細(xì)胞局部移植于裸鼠燙傷腳掌觀察汗腺組織再生修復(fù)情況，結(jié)合碘-淀粉發(fā)汗實(shí)驗(yàn)檢測(cè)汗腺功能以判定治療效果；選擇一例燒傷自愿患者，該患者雙上臂背側(cè)均有相似的瘢痕，經(jīng)發(fā)汗實(shí)驗(yàn)證明無(wú)汗液分泌。經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和知情同意條件

5、下，抽取其骨髓和切取小塊正常皮膚分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和汗腺細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞獲得汗腺細(xì)胞表型，通過(guò)自行設(shè)計(jì)的方案將該細(xì)胞種植于右側(cè)切除瘢痕處。創(chuàng)面愈合后實(shí)驗(yàn)側(cè)行發(fā)汗實(shí)驗(yàn)、汗液成份分析以及組織學(xué)檢查。 結(jié)果： 1.去基底細(xì)胞層處理的表皮片干細(xì)胞標(biāo)志物CK19和β1整合素染色陰性；移植后5d，存活皮片CK19和β1整合素染色呈多層分布，而不是正常表皮中的單層分布。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，表皮片移植后CK

6、19陽(yáng)性細(xì)胞和β1整合素陽(yáng)性細(xì)胞分別由移植前的0.00％和0.00％增加到7.54％和5.24％，而CK10陽(yáng)性細(xì)胞由99.62％下降為86.56％。Western bloting和PCR檢測(cè)也證實(shí)CK19和β1整合素蛋白水平和mRNA水平表達(dá)在移植后明顯增強(qiáng)。免疫組化染色顯示，去除干細(xì)胞的瘢痕表皮和角膜上皮在移植后有大量干細(xì)胞標(biāo)志物CK19、β1整合素和CK14、CK5陽(yáng)性細(xì)胞的分布。 2.經(jīng)熱和bFGF誘導(dǎo)后的表皮細(xì)胞出現(xiàn)蛋

7、白、形態(tài)、功能和基因水平的改變。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)顯示細(xì)胞誘導(dǎo)后CK19和β1整合素染色呈陽(yáng)性；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示CK19和β1整合素陽(yáng)性率在誘導(dǎo)前分別為0.00％和0.00％，誘導(dǎo)后7d和14d CK19陽(yáng)性率增加到83.01％和90.42％，β1整合素陽(yáng)性率增加到83.63％和93.88％；Western bloting檢測(cè)顯示，表皮細(xì)胞在去分化誘導(dǎo)前CK19和β1整合素均無(wú)表達(dá)，誘導(dǎo)后7d和14d CK19和β1整合素出現(xiàn)不同程

8、度的表達(dá)。Giemsa染色和透射電鏡觀察顯示細(xì)胞誘導(dǎo)后形態(tài)發(fā)生改變，表現(xiàn)為體積減小，細(xì)胞器數(shù)目減少，核漿比增大。增殖和再分化能力的改變體現(xiàn)在誘導(dǎo)后的表皮細(xì)胞能形成克隆，在滋養(yǎng)層培養(yǎng)條件下可以形成復(fù)層生長(zhǎng)，并能夠在體外構(gòu)建出包括基底層和基底上層在內(nèi)的表皮結(jié)構(gòu)?；蛩降母淖儽憩F(xiàn)在與角質(zhì)化相關(guān)的基因下調(diào)和與有絲分裂相關(guān)的基因上調(diào)。 3.體外激活β-catenin通路可以促使表皮細(xì)胞表達(dá)CK19和β1整合素，克隆形成和進(jìn)入細(xì)胞分裂周期

9、；而通過(guò)siRNA抑制β-catenin的表達(dá)可以阻斷由熱和bFGF誘導(dǎo)的去分化過(guò)程。免疫熒光染色顯示，Smad4敲除小鼠表皮細(xì)胞核內(nèi)β-catenin表達(dá)增強(qiáng)，CK14和Ki67表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞大量多層分布于表皮組織內(nèi)。 4.MSCs和SGCs在體外均呈克隆樣生長(zhǎng)；MSCs表達(dá)CD29、CD44、CD71、CD105和CD166，不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志CD34和CD45，以及汗腺細(xì)胞標(biāo)志CK19和CEA。加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基后MSCs可以

10、向骨和脂肪細(xì)胞分化；培養(yǎng)的SGCs表達(dá)CK19和CEA；SGCs經(jīng)高溫?fù)p傷后，大多數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞間連接消失；BrdU或GFP標(biāo)記的MSCs和損傷的SGCs共培養(yǎng)5d后，部分MSCs表達(dá)汗腺細(xì)胞標(biāo)志CK19或CEA；發(fā)汗實(shí)驗(yàn)和形態(tài)學(xué)觀察證實(shí)將具有汗腺細(xì)胞表型的干細(xì)胞移植于裸鼠創(chuàng)而后，能顯著促進(jìn)受損汗腺的修復(fù)與再生。人體移植試驗(yàn)表明，經(jīng)種植誘導(dǎo)的汗腺細(xì)胞后，病人創(chuàng)面愈合部位呈現(xiàn)出汗功能，對(duì)照部位發(fā)汗實(shí)驗(yàn)陰性，形態(tài)學(xué)檢測(cè)顯示創(chuàng)部真皮淺層經(jīng)汗腺移

11、植后有大量CEA陽(yáng)性細(xì)胞，結(jié)構(gòu)類似正常汗腺組織。汗液成分分析結(jié)果顯示治療處收集的汗液與正常皮膚處收集的汗液具有類似的pH值，滲透壓和化學(xué)組分。 結(jié)論： 1.在特定損傷環(huán)境和特定因素的誘導(dǎo)下，已分化的表皮細(xì)胞可去分化為表皮干細(xì)胞或表皮干細(xì)胞樣細(xì)胞。 2.表皮細(xì)胞的去分化過(guò)程與β-catenin/Wnt信號(hào)通路有關(guān)。 3.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以在體外成功誘導(dǎo)為汗腺細(xì)胞，經(jīng)移植后，在創(chuàng)面能形成具有功能的汗腺組織。