去分化表皮細(xì)胞重獲再生表皮能力的研究.pdf

1、一、研究背景和目的
　　 較大面積重度的全身燒創(chuàng)傷患者，通過皮膚移植等常規(guī)手術(shù)方法，幾乎無一避免會(huì)出現(xiàn)創(chuàng)面瘢痕愈合的結(jié)局。雖然表皮干細(xì)胞對(duì)于嚴(yán)重創(chuàng)面修復(fù)的組織工程學(xué)具有重要幫助，但重度全身燒傷患者殘存的正常皮膚很少，正常皮膚的表皮干細(xì)胞數(shù)量本身就很有限，只占正常表皮基底層的1%-10%，干細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)達(dá)不到修復(fù)上述創(chuàng)面的要求，顯然這會(huì)明顯限制干細(xì)胞組織工程技術(shù)在臨床上的廣泛應(yīng)用。是否有可以解決表皮干細(xì)胞短缺，獲得足量的表皮干細(xì)胞將

2、其移植到創(chuàng)面，最終可能實(shí)現(xiàn)創(chuàng)面的“完美修復(fù)”這樣的方法呢？
　　 去分化就是獲得大量成體干細(xì)胞的途徑之一，表皮細(xì)胞存在去分化現(xiàn)象。已分化成熟的終末分化表皮細(xì)胞通過去分化可以反向分成他們的父輩細(xì)胞，也就是說，表皮細(xì)胞可以從“年老的”分化狀態(tài)返回到“年輕的”不完全分化、甚至具有表皮干細(xì)胞特征的幼稚狀態(tài)的過程。而這些去分化來源的“年輕”細(xì)胞可用于上述創(chuàng)面治療。我們?nèi)绾沃鲃?dòng)地將已分化細(xì)胞在體外為誘導(dǎo)成為分化程度較低形式的細(xì)胞，甚至分化程

3、度更低的再生皮膚能力更強(qiáng)的表皮干細(xì)胞呢？
　　 答案是肯定的。有報(bào)道，某些特定因素可以誘導(dǎo)表皮細(xì)胞去分化。因此，建立可靠而穩(wěn)定的去分化方法將從根本上解決上述疾病治療面臨的表皮干細(xì)胞數(shù)量短缺的嚴(yán)重問題。去分化方法是一符合道德、倫理規(guī)范的替代方案，沒有遺傳不相容和組織排斥風(fēng)險(xiǎn)。
　　 成熟細(xì)胞去分化時(shí)涉及幾條復(fù)雜的信號(hào)通路，如wnt/β-連環(huán)蛋白、p38、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)和Janus激酶(JAK)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄

4、激活因子(STAT)信號(hào)通路。但尚未有研究報(bào)告誘導(dǎo)分化表皮細(xì)胞退回到有再生能力不成熟狀態(tài)的通路。越來越多的證據(jù)表明，Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)于皮膚的正常發(fā)育十分必要，Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵效應(yīng)器是參與維持皮膚祖細(xì)胞群的β-連環(huán)蛋白。研究亦表明，β-連環(huán)蛋白水平升高會(huì)導(dǎo)致表皮干細(xì)胞增生并誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為毛囊干細(xì)胞。
　　 本研究第一部分是在前期表皮干細(xì)胞工作基礎(chǔ)上，繼續(xù)探討并確立穩(wěn)定的表皮干細(xì)胞培養(yǎng)體系，為深入去分化研究奠定基礎(chǔ)。第二部分特

5、別針對(duì)性探討β-連環(huán)蛋白活化對(duì)于分化表皮細(xì)胞特性的影響。首先應(yīng)用氯化鋰(LiCl)和高度特異性GSK-3β抑制劑誘導(dǎo)β-連環(huán)蛋白表達(dá)，然后針對(duì)β-連環(huán)蛋白活化對(duì)于去分化細(xì)胞的形態(tài)、表型和生長特性的影響進(jìn)行觀察，最后對(duì)比去分化細(xì)胞體外再生表皮的能力。
　　 二、方法
　　 新鮮人包皮片前期處理后，用中性蛋白水解酶分離得到表皮，制成單細(xì)胞懸液，用差速貼壁法移去已分化表皮細(xì)胞，光鏡和電鏡下觀察表皮干細(xì)胞的特點(diǎn)，并使用表皮干細(xì)胞

6、標(biāo)記物鑒定。利用差速貼壁法從表皮片中分離出人體表皮細(xì)胞接種于6孔板并分為3組，即對(duì)照組(無處理組)，LiCl處理組和GSK-3β抑制劑處理組。應(yīng)用LiCl和高度特異性GSK-3β抑制劑活化β-連環(huán)蛋白表達(dá)，針對(duì)β-連環(huán)蛋白活化對(duì)于去分化細(xì)胞的形態(tài)、表型和生長特性的影響觀察，并對(duì)比細(xì)胞體外再生表皮的能力。
　　 三、結(jié)果
　　 差速貼壁法分離表皮得到的表皮干細(xì)胞具有干細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)，光鏡下細(xì)胞貼壁生長，由小圓珠狀漸成方形的

7、鋪路石狀。電鏡下核大，細(xì)胞器少，為典型非成熟細(xì)胞。2周后原代細(xì)胞鋪滿瓶底。用含生長促進(jìn)因子的DMEM/F12培養(yǎng)的表皮干細(xì)胞24h即可伸展貼壁和伸展，原代細(xì)胞3-4d即鋪滿瓶底。原代培養(yǎng)的表皮干細(xì)胞免疫組化顯示表皮干細(xì)胞的系列表面標(biāo)記物，不表達(dá)已分化表皮細(xì)胞的標(biāo)記物CK10。
　　 3組細(xì)胞中，免疫印跡和光動(dòng)力學(xué)分析顯示β-連環(huán)蛋白在LiCl組和GSK-3β抑制劑組表皮細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)較未處理組顯著增高。培養(yǎng)3、6d時(shí)，倒置相差顯

8、微鏡下見兩處理組細(xì)胞表現(xiàn)為表皮干細(xì)胞的典型變化。免疫組化分析表明兩處理組CK10表達(dá)的數(shù)量和比例均顯著下降，而表皮干細(xì)胞的標(biāo)記物CK19和β1整合素的表達(dá)加強(qiáng)。與對(duì)照組相比，Oct4和Nanog基因在去分化的處理組細(xì)胞中高4-6倍。3d時(shí)兩處理組已明顯的集落形成，而對(duì)照組生長稀疏。流式細(xì)胞儀檢測出的細(xì)胞周期數(shù)據(jù)表明兩處理組中有較多細(xì)胞處于增殖期，且與對(duì)照組有顯著差異。持續(xù)傳代培養(yǎng)表明兩處理組有更強(qiáng)的遠(yuǎn)期增殖潛能。培養(yǎng)11d后，對(duì)照組未成

9、表皮單層，但處理組和表皮干細(xì)胞組在真皮替代物表面再生了復(fù)層表皮。
　　 四、結(jié)論
　　 采用中性蛋白酶選擇性的水解真皮和表皮之間的細(xì)胞連接，再用差速貼壁法分離表皮干細(xì)胞是一種高效的表皮干細(xì)胞獲取方法。含10% FBS低糖DMEM/F12是可以保持表皮干細(xì)胞去分化狀態(tài)的良好培養(yǎng)基。
　　 表皮細(xì)胞在分化后能夠因β-連環(huán)蛋白的表達(dá)增加而重新恢復(fù)表皮干細(xì)胞的特征。LiCl和GSK-3β抑制劑處理可引起分化后表皮細(xì)胞胞核