纖維素酶產(chǎn)生菌Thermobifida alba F-7的鑒定、酶學(xué)性質(zhì)、產(chǎn)酶優(yōu)化及糖化研究.pdf

1、纖維素是由葡萄糖單元通過β-1,4-糖苷鍵結(jié)合聚合而成的高分子,是植物細(xì)胞壁的主要組成部分,是全球最豐富的可再生資源,是最具有潛力的可再生原料來源,在纖維素降解利用研究領(lǐng)域,高效纖維素降解酶和高效產(chǎn)酶菌株的選育一直是研究的重點。
　　本實驗室從高溫堆肥中篩選到一株白色高溫雙歧菌(Thermobifida alba F-7)。目前,國內(nèi)外對其研究相對較少。本文對其進(jìn)行初步研究發(fā)現(xiàn),T.alba F-7所產(chǎn)纖維素酶和木聚糖酶具有較好的

2、耐高溫特性,為進(jìn)一步提高菌株的產(chǎn)酶性能,探討該菌的應(yīng)用價值,本論文針對Thermobifida alba F-7進(jìn)行了系統(tǒng)研究。
　　首先從菌株的菌落形態(tài)、菌絲狀態(tài)及生理生化分析方面對其進(jìn)行了進(jìn)一步的鑒定。該菌呈簇生長,菌落的氣生菌絲呈二叉分枝狀不斷延伸,氣生菌絲體內(nèi)無隔膜,氣生菌絲白色。孢子單個著生于小直孢子梗上,孢子為橢圓形或是圓形。研究發(fā)現(xiàn)該菌革蘭氏染色陽性,能夠產(chǎn)生胞外蛋白酶、凝乳酶、纖維素酶、淀粉酶以及木聚糖酶等,酶系較

3、齊全。以上特征與高溫雙歧菌屬的典型菌株白色高溫雙歧菌完全一致。對其粗酶液性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn),T.alba F-7所產(chǎn)纖維素酶和木聚糖酶的最適pH中性偏酸,粗酶液在pH4～10緩沖液中處理一小時后酶活性不變,具有良好的耐酸堿性。其纖維素酶的最適反應(yīng)溫度為60℃,木聚糖酶最適反應(yīng)溫度達(dá)70℃,而且粗酶液在60℃下處理一小時后粗酶液的酶活變化很小,具有良好的熱穩(wěn)定性,因此,具有潛在的應(yīng)用價值。
　　為提高菌株的產(chǎn)酶水平,依次通過單因子法、析因

4、設(shè)計、最陡爬坡試驗以及響應(yīng)面對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化。單因素試驗中篩選出最佳碳源為1%復(fù)合碳源(麩皮:木糖渣=1:1)、最優(yōu)氮源為0.5%玉米漿干粉等,使菌株產(chǎn)纖維素酶提高近8倍,木聚糖酶提高近10倍。Plackett-Burman實驗設(shè)計篩選出碳源、玉米漿干粉和磷酸氫二鈉三個主效因素,利用響應(yīng)面法建立了T.alba F-7可靠的發(fā)酵模型,通過回歸分析準(zhǔn)確預(yù)測了最優(yōu)組合。使該菌產(chǎn)纖維素酶由最初的1.2IU/mL提高到13.4 IU/m

5、l,提高了11倍左右。
　　使用傳統(tǒng)的紫外線誘變于段對菌株進(jìn)行了遺傳育種,以提高菌株產(chǎn)纖維素酶的能力。通過甲板初篩和搖瓶復(fù)篩,獲得四株產(chǎn)酶性能提高、遺傳穩(wěn)定的突變菌株(UV-59、UV-114、UV-134以及UV-148),產(chǎn)酶能力提高了50%左右。
　　為進(jìn)一步了解該菌所產(chǎn)耐高溫纖維素酶在工業(yè)應(yīng)用中的潛力,將該菌及其突變菌株產(chǎn)生的粗酶液對工業(yè)廢棄物木糖渣進(jìn)行了糖化酶解,測得糖化液中主要成分為纖維二糖,葡萄糖含量相對較少,