桔小實蠅GSTs生化及分子毒理學(xué)特性研究.pdf

1、桔小買蠅Bactroceradorsalis(Hendel)隸屬雙翅目Diptera，實蠅科Tephritidae，果買蠅屬BactroceraMacquar，是一種重要的危險性果蔬害蟲。鑒于桔小實蠅在生產(chǎn)上的經(jīng)濟重要性，近年來有關(guān)桔小實蠅種群遺傳結(jié)構(gòu)、引誘劑研發(fā)、化學(xué)防治等方面的研究日益增多。然而，長期持續(xù)、不合理的使用化學(xué)殺蟲劑導(dǎo)致其產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性。目前，桔小實蠅抗性機理方面的研究主要集中于靶標(biāo)酶-乙酰膽堿酯酶的生化及分子生物學(xué)

2、特性，而對于解毒酶系與桔小實蠅抗性發(fā)展的關(guān)系知之甚少。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(gluthioneS-transferase，GSTs，EC2.5.1.18)是一類多功能超基因家族酶。GSTs作為重要的解毒代謝酶，主要功能是催化一些內(nèi)源性或外來有害物質(zhì)的親電子基團與還原型谷胱甘肽的巰基結(jié)合，增加其疏水性使其易于排出體外，從而達到解毒的目的。目前已知昆蟲特有的GSTsDelta和Epsilon家族成員參與了昆蟲對有機磷類、有機氯類和擬除蟲菊酯類

3、殺蟲劑抗性的形成。
　　 本學(xué)位論文以桔小實蠅為研究對象，瞄準(zhǔn)昆蟲適應(yīng)逆境脅迫的機理這一研究熱點，系統(tǒng)開展了桔小實蠅GSTs生化毒理學(xué)特性、GSTS基因的全長序列克隆、轉(zhuǎn)錄表達模式及異源表達研究。研究結(jié)果將有助于闡明桔小實蠅對殺蟲劑抗性產(chǎn)生和發(fā)展的分子毒理學(xué)機理，從而在實踐中建立基于GSTs的自然種群抗性的分子診斷技術(shù)。旨在為桔小實蠅的可持續(xù)治理提供理論依據(jù)，同時豐富和發(fā)展昆蟲抗性機理研究的科學(xué)理論和技術(shù)體系。通過近三年的研究，

4、取得的主要研究結(jié)果如下：
　　 1桔小實蠅GSTs的純化及生化毒理學(xué)特性
　　 1.1桔小實蠅不同種群GSTs的純化及生化毒理學(xué)特性
　　 采用GlutathioneSepharose4B親和層析法對桔小實蠅4個地理種群(東莞、廣州、海南和云南)的GSTs進行了分離純化和生化毒理學(xué)特性解析。結(jié)果表明，桔小實蠅4個種群GSTs純化后的比活力相似，但廣州種群的GSTs純化回收率最低(31.54％)。聚丙酰胺凝膠電泳顯

5、示4個種群GSTs均只有一條大小為23kDa的條帶。以CDNB為底物時，東莞和海南種群GSTs的Km值顯著地高于廣州和云南種群；海南種群GSTs的Vmax值在4個種群間最高。4個種群的GSTs最適反應(yīng)溫度均是37℃，最適pH值為7.5。離體抑制作用測定結(jié)果表明，利尿酸、四溴磺酚鈉、馬來酸二乙酯、雙硫侖、姜黃素和高效氯氰菊酯均對桔小實蠅GSTs有很高的抑制率，而馬拉硫磷和阿維菌素對桔小實蠅4個種群GSTs的抑制率均未到達50％。結(jié)果暗示G

6、STs可能介導(dǎo)桔小實蠅對高效氯氰菊酯的代謝抗性。
　　 1.2桔小實蠅不同發(fā)育階段GSTs的純化及生化毒理學(xué)特性
　　 采用GlutathioneSepharose4B親和層析法對桔小實蠅不同發(fā)育階段(三齡幼蟲、蛹、成蟲)GSTs進行了分離純化和生化毒理學(xué)特性解析。結(jié)果表明，洗脫得到的桔小實蠅GSTs活性主要集中在洗脫收集到的3-5管。桔小實蠅成蟲GSTs的總活性和比活力分別是370.76nmol.min-1和16.91

7、nmol.min-1.μg-1，且顯著高于三齡幼蟲和蛹期。SDS-PAGE結(jié)果顯示，桔小實蠅3個發(fā)育階段的GSTs純化后均獲得單一條帶，且分子量大小均為23kDa。無論以CDNB或GSH為底物時，桔小實蠅幼蟲期GSTs的Km值均顯著低于蛹和成蟲期，而3個發(fā)育階段間GSTs的Vmax無顯著性差異。桔小實蠅3個發(fā)育階段的GSTs最適反應(yīng)溫度均是37℃，最適pH值為7.5。利尿酸(1.15μM)和馬來酸二乙酯(0.60μM)對桔小實蠅成蟲期G

8、STs的I50顯著地低于其余兩個發(fā)育階段；四溴磺酚鈉對桔小實蠅不同發(fā)育階段GSTs的I50無顯著差異；雙硫侖對蛹和成蟲期GSTs的I50均顯著地高于三齡幼蟲，而蛹和成蟲間無顯著差異；姜黃素對桔小實蠅成蟲GSTs的I50(101.78μM)顯著地高于三齡幼蟲和蛹期；高效氯氰菊酯對蛹和成蟲期GSTs的I50(0.90和0.78mM)顯著地高于幼蟲階段；但馬拉硫磷和阿維菌素對桔小實蠅3個發(fā)育階段的GSTs的抑制率均未到達50％。結(jié)果暗示桔小實

9、蠅幼蟲期對殺蟲劑高效氯氰菊酯相對更為敏感。
　　 2桔小實蠅GSTs基因的克隆與序列分析
　　 基于桔小實蠅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用RACE技術(shù)，從桔小實蠅體內(nèi)分離克隆了18個GSTs基因的cDNA全長序列。通過序列分析，確定了這18個GSTs基因的開放閱讀框，并推導(dǎo)了其編碼的氨基酸序列。進一步利用Protparam等生物信息學(xué)軟件分析了推導(dǎo)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)。依據(jù)其在細胞中的定位，將這18個GSTs基因分為胞質(zhì)型和微粒體型兩大類

10、，分別包含17個和1個基因。根據(jù)黑腹果蠅、岡比亞按蚊、埃及伊蚊GSTs基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，將其中的4個基因歸類于Delta家族，8個基因歸類于Epsilon家族，2個基因歸類于Omega家族，另分別有1個基因歸類于Theta和Zeta家族，而余下的1個基因則不能劃分在已知的類型中，暫將其歸為未分類家族Unclassified。這些胞質(zhì)GSTs基因根據(jù)命名法則命名并在GenBank上登錄，其名稱和登錄號分別為：BdGSTd1(JQ6900

11、90)、BdGSTd2(JN003593)、BdGSTd5(JN792452)、BdGSTd6(JN792453)、BdGSTe1(JN003588)、BdGSTe2(JN003589)、BdGSTe3(JQ690091)、BdGSTe4(JN003590)、BdGSTe5(JN003591)、BdGSTe6(JQ690092)、BdGSTe7(JN003592)、BdGSTe9(JQ690093)、BdGSTo1(JQ690094)、

12、BdGSTo2(JQ690095)、BdGSTt1(JQ690096)、BdGSTz2(JQ690097)和BdGSTu1(JN003587)。其中，Delta家族基因問的氨基酸同源性介于47.6-57.9％，Epsilon家族基因間的氨基酸的同源性范圍為31.8-54.9％，Omega家族基因的氨基酸同源性高達85.4％，而在任意的非同一家族之間，氨基酸序列同源性僅在12.4-30％之間，但BdGSTu1與BdGSTe9的氨基酸特異性

13、為35.9％。此外對這些GSTs基因進行分子特性分析，明確了酶促結(jié)合位點和維持酶活性構(gòu)象的關(guān)鍵氨基酸殘基。通過克隆并驗證獲得桔小實蠅微粒體GSTs基因1個，命名為BdGSTm1，GenBank登錄號JQ690098。BdGSTm1基因與黑腹果蠅DmGSTm-NP524696的氨基酸序列一致性高達91％。桔小實蠅和其它雙翅目昆蟲微粒體GSTs的多重比對分析發(fā)現(xiàn)，桔小實蠅微粒體GSTs基因中含有昆蟲微粒體GSTs中特有的結(jié)構(gòu)域D-P-X-V

14、-E-R-V-R-R-A-H-X-N-D-X-E-N-I-L-P，且昆蟲微粒體GSTs的氨基酸序列較短，通常在150個氨基酸左右。
　　 3桔小實蠅GSTs基因的表達模式解析
　　 3.1桔小實蠅GSTs基因在不同發(fā)育階段的表達模式
　　 在成功建立了桔小實蠅18個GSTs基因的qPCR反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上，以桔小實蠅α-Tubulin基因作為內(nèi)參基因，對這18個GSTs基因在不同發(fā)育階段(卵、一齡、二齡、三齡幼蟲、

15、蛹和成蟲)mRNA表達水平進行了相對定量分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，桔小實蠅卵期僅BdGSTe1基因過量表達，暗示該基因可能與保幼激素和蛻皮激素的調(diào)控存在關(guān)聯(lián)；桔小實蠅6個GSTs基因(BdGSTd2、BdGSTd5、BdGSTe5、BdGSTe9、BdGSTt1和BdGSTz2)在幼蟲期的相對表達量高于成蟲期，暗示參與了幼蟲期的代謝活動；桔小實蠅BdGSTe2、BdGSTe3、BdGSTe4和BdGSTe6基因隨著桔小實蠅的生長發(fā)育，表達量增加上

16、調(diào)，這表明在桔小實蠅個體發(fā)育過程中解毒代謝能力也隨之增強。
　　 3.2桔小實蠅GSTs基因在不同組織部位的表達模式
　　 以α-Tubulin基因為內(nèi)參基因，對18個GSTs基因在桔小實蠅中腸、脂肪體和馬氏管3個組織中的mRNA表達水平進行了相對定量分析。結(jié)果表明，桔小實蠅BdGSTd5、BdGSTe3和BdGSTe9基因在中腸中的表達量最高，而且這3個GSTs基因都歸屬于昆蟲特有的家族，暗示這些基因可能在外源化合物解

17、毒代謝過程中起著重要的功能作用。其它GSTs基因在中腸不表達，可能在其他組織中起著類似的功能作用。桔小實蠅BdGSTd6、BdGSTe4、BdGSTe6和BdGSTz2基因在脂肪體中相對表達量最高，表明這些基因可能參與解毒代謝外源化合物或保護機體免受氧化應(yīng)激。桔小實蠅BdGSTd1、BdGSTe1、BdGSTe2、BdGSTe5、BdGSTe7和BdGSTu1基因在馬氏管中有較高的表達量。GSTs基因在桔小實蠅馬氏管中的具體作用還不清楚

18、，推測可能和參與增強馬氏管的排泄作用有關(guān)。
　　 3.3桔小實蠅GSTs基因在3種殺蟲劑誘導(dǎo)后的表達模式
　　 利用有機磷類殺蟲劑馬拉硫磷、生物源殺蟲劑阿維菌素及擬除蟲菊酯類殺蟲劑高效氯氰菊酯對桔小實蠅進行不同時間和劑量誘導(dǎo)，進而應(yīng)用qPCR技術(shù)解析桔小實蠅18個GSTs基因在藥劑誘導(dǎo)后的表達模式。結(jié)果表明，馬拉硫磷對桔小實蠅誘導(dǎo)的時間效應(yīng)中，5個GSTs基因(BdGSTd6、BdGSTe4、BdGSTe5、BdGSTe

19、6和BdGSTm1)誘導(dǎo)12h后相對表達量最高，2個GSTs基因(BdGSTd2和BdGSTo1)誘導(dǎo)24h后相對表達量達最高峰，而另外8個GSTs基因(BdGSTd1、BdGSTe1、BdGSTe2、BdGSTe3、BdGSTo2、BdGSTt1、BdGSTz2和BdGSTu1)相對表達量的最高峰延遲到誘導(dǎo)后48h，說明這些GSTs基因可能均參與馬拉硫磷在桔小實蠅體內(nèi)的代謝過程。馬拉硫磷亞致死劑量(LD10)處理桔小實蠅24h后，10

20、個GSTs基因(BdGSTd1、BdGSTd5、BdGSTd6、BdGSTe2、BdGSTe4、BdGSTe5、BdGSTe6、BdGSTo2、BdGSTtl和BdGSTu1)相對表達量最高，表明這些基因可能介導(dǎo)桔小實蠅對馬拉硫磷的代謝抗性。
　　 阿維菌素對桔小實蠅誘導(dǎo)的時間效應(yīng)中，2個GSTs基因(BdGSTe6和BdGSTm1)誘導(dǎo)12h后相對表達量最高，6個GSTs基因(BdGSTd1、BdGSTd2、BdGSTd5、B

21、dGSTd6、BdGSTe4和BdGSTe9)誘導(dǎo)24h后相對表達量達最高峰，阿維菌素致死中劑量(LD50)誘導(dǎo)桔小實蠅24h后，7個GSTs基因(BdGSTd2、BdGSTd5、BdGSTd6、BdGSTe4、BdGSTe5、BdGSTe6和BdGSTm1)相對表達量達到最高峰，暗示這些GSTs基因可能均參與阿維菌素在桔小實蠅體內(nèi)的解毒代謝作用。
　　 高效氯氰菊酯對桔小實蠅誘導(dǎo)的時間效應(yīng)中，3個GSTs基因(BdGSTe2、

22、BdGSTe5和BdGSTe6)誘導(dǎo)12h后相對表達量最高，而另外6個GSTs基因(BdGSTe4、BdGSTe9、BdGSTo2、BdGSTt1、BdGSTu1和BdGSTm1)相對表達量的最高峰延遲到誘導(dǎo)后36h，說明這些GSTs基因可能均參與高效氯氰菊酯在桔小實蠅體內(nèi)的代謝過程。而高效氯氰菊酯亞致死劑量(LD10)誘導(dǎo)桔小實蠅后，BdGSTd1、BdGSTe4、BdGSTe7和BdGSTt1基因表達上調(diào)，暗示桔小實蠅GSTs基因可

23、能參與高效氯氰菊酯的解毒代謝過程。
　　 3.4桔小實蠅GSTs基因在不同品系中的表達模式
　　 采用定量PCR技術(shù)，以α-Tubulin基因為內(nèi)參基因，解析克隆獲得的桔小實蠅18個GSTs基因在實驗室選育并保存的桔小實蠅馬拉硫磷和高效氯氰菊酯抗性品系及敏感品系中的表達模式。結(jié)果表明，在馬拉硫磷抗性品系中，BdGSTd5、BdGSTe9和BdGSTz2基因的相對表達量顯著高于敏感品系，而BdGSTe1、BdGSTe2和B

24、dGSTt1在抗性品系中的相對表達量顯著低于敏感品系。暗示這些GSTs基因可能介導(dǎo)了桔小實蠅對馬拉硫磷抗性的形成。桔小實蠅高效氯氰菊酯抗性品系中，8個GSTs基因(BdGSTd6、BdGSTe1、BdGSTe2、BdGSTe5、BdGSTe6、BdGSTe7、BdGSTt1和BdGSTm1)在抗性品系中的相對表達量顯著高于敏感品系，暗示這些基因可能參與了桔小實蠅對高效氯氰菊酯的解毒代謝作用。
　　 4桔小實蠅BdGSTe5基因的

25、原核表達
　　 采用NdeⅠ和HindⅢ雙酶切位點及DNA重組技術(shù)構(gòu)建了桔小實蠅BdGSTe5基因基于BdGSTe5-pET28a(+)的原核表達質(zhì)粒，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)含有重組質(zhì)粒BdGSTe5-pET28a(+)的細菌中在27kDa下方有一條特異性的蛋白質(zhì)條帶。根據(jù)蛋白質(zhì)分子量估算，表達的融合蛋白質(zhì)分子量大約為26kDa，由于6×His-tag標(biāo)簽及其側(cè)翼序列片段大約占1kDa，因此該特異性條帶分子量

26、與預(yù)期表達的融合蛋白大小相一致。采用Ni柱和DEAE柱依次對BdGSTe5-pET28a(+)重組蛋白進行純化，經(jīng)SDS-PAGE驗證，在分子量為27kDa處獲得單一條帶。
　　 綜上所述，通過親和層析法分離純化GSTs并比較研究純化產(chǎn)物的動力學(xué)和毒理學(xué)特性；應(yīng)用高通量測序及RACE技術(shù)克隆桔小實蠅GSTs基因的全長序列，結(jié)合qPCR技術(shù)解析其mRNA在桔小實蠅不同發(fā)育階段、不同組織部位和不同品系中的表達模式，鑒定了參與該蟲抗性